蟬蛻水提物對小鼠D—氨基半乳糖急性肝損傷的保護作用

李兆疊+陸秋娜+齊梁煜+楊文林+零新嵐+韋家河+黃彥峰+馮雪萍

摘要：探討不同濃度蟬蛻水提取物對小鼠D-氨基半乳糖（D-GalN）急性肝損傷的保護作用。將60只小鼠隨機分為空白對照組、D-GalN模型組（模型組）、聯苯雙酯滴丸組、蟬蛻水提取物低、中、高3個劑量組，共6組。每組小鼠均按每千克體重劑量灌胃給藥，連續給藥13 d，末次給藥12 h后，按600 mg/kg腹腔注射10% D-GalN誘導急性肝損傷模型。造模24 h后，計算小鼠肝指數，測定血清中谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）活性及心肌組織、肝組織中超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量，HE染色觀察肝組織病理學變化。結果表明，與空白對照組比較，模型組小鼠肝臟指數及血清ALT、AST活性升高（P<0.01），肝臟、心肌組織中SOD活性降低，MDA含量增高（P<0.01），肝組織炎癥壞死廣泛。與模型組比較，蟬蛻水提取物的低、中、高劑量組及聯苯雙酯組小鼠肝臟指數及血清ALT、AST活性降低（P<0.01或P<0.05），肝臟、心肌組織中SOD活性升高，MDA含量降低（P<0.01或P<0.05），肝組織損傷程度顯著改善。蟬蛻水提取物對D-GalN誘導的小鼠急性肝損傷有一定的保護作用。

關鍵詞：蟬蛻；D-氨基半乳糖；肝損傷；保護作用

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）12-2313-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.12.028

Protective Effect of Periostracum cicdae Water Extract on D-galactosamine Induced Acute Liver Injury in Mice

LI Zhao-die，LU Qiu-na，QI Liang-yu，YANG Wen-lin，LING Xin-lan，

WEI Jia-he，HUANG Yan-feng，FENG Xue-ping

（Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000，Guangxi， China）

Abstract：To explore the protective effect of Periostracum cicdae water extract on D-GalN induced acute liver injury in mice.60 mice were randomly divided into 6 groups，blank control group，D-GalN model group （model group），bifendate pills group，water extract of Periostracum Cicadae low，middle，and high dose group. Each group of mice per kg of body weight dose administered by gastric administration，continuous administration of 13 d，on the last day of administration，according to the dosage of 600 mg/kg intraperitoneal injection of 10% D-GalN induced acute liver injury model. Modeling for 24 h，the calculation of the liver index，serum alanine aminotransferase（ALT），aspartate aminotransferase（AST） activity and myocardial tissue，liver tissue superoxide dismutase（SOD） activity and malondialdehyde（MDA） content. HE staining and pathological changes of liver tissue were observed. Results showed that compared with the blank control group，the liver index and the serum ALT，AST activity increased（P<0.01），liver，myocardial tissue SOD activity decreased，MDA content increased（P<0.01），liver tissue inflammatory necrosis of the liver.Compared with the model group，cicada slough water extract of low， middle，high dose group and bifendate pills groups of mice liver index and serum ALT，AST activity reduce （P<0.01 or P<0.05），liver，the myocardial tissue of SOD in myocardium increased，decreased the content of MDA（P<0.01 or P<0.05），The degree of liver tissue injury was significantly improved. The water extract of Periostracum cicdae has protective effect on D-GalN induced acute liver injury in mice.

Key words：Periostracum cicdae； D-galactosamine； liver injury； protective effect

隨著人類生活環境及飲食習慣的改變，肝臟疾病已成為威脅人類重要疾病之一，在中國以病毒性肝炎為主。因此，尋求抗肝損傷、肝纖維化等藥物日益受到關注[1-3]。

蟬蛻為蟬科（Periostracum cicdae）昆蟲黑蚱的幼蟲羽化時脫落的皮殼。蟬蛻性甘、寒，歸肺、肝經。蟬蛻內含甲殼質（chitin）、蝶啶類色素、異黃質喋呤（isoxanthopterin）、赤蝶呤（erythropterin）、蛋白質、氨基酸、有機酸、酚類等化合物。蟬蛻有疏散風熱、利咽、透疹、明目退翳、解痙等功能，目前臨床上常用于治療風熱感冒、咽痛音啞、麻疹不透、風疹瘙癢、目赤翳障、驚風抽搐、破傷風[4]、疏風除熱、哮喘[5]等疾病。本試驗以小鼠為研究對象，初步探討蟬蛻水提取物對D-氨基半乳糖胺致小鼠急性肝損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 蟬蛻，購買于廣西壯族自治區百色市某大藥房；聯苯雙酯滴丸（廣州白云山星群藥業股份有限公司，批號A02141102）；D-氨基半乳糖（D-GaIN，上海源葉生物科技有限公司，批號YS0918TA14）；谷丙轉氨酶（ALT）、 天冬氨酸轉氨酶（AST）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、考馬斯亮藍（均購于南京建成生物工程研究所，批號分別為20150918、20150909、20150922、20150820、20150923）。

1.1.2 儀器 TD24A-WS型低速臺式離心機、722型可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司），XW-80A型旋渦混合器（上海醫科大學儀器廠），FSH-2A型可調高速電動勻漿機（金壇市金南儀器廠），TGL-16G型離心機（上海安亭科學儀器），HH-W600型三用恒溫水浴箱。

1.1.3 動物 昆明種小鼠60只，雌雄各半，體重23～27 g，由右江民族醫學院動物實驗中心提供，合格證：SCXK（桂）2012-0003。

1.2 方法

1.2.1 蟬蛻提取物的制備[6] 將蟬蛻放入清水中反復清洗，直至清洗蟬蛻的水變清澈，放入烘干箱中烘干，冷卻后粉碎并準確稱取100 g，按料液比1∶10加入1 000 mL蒸餾水，冷凝回流提取1 h，冷卻至室溫后過濾，保存濾液并重新收集濾渣，再按料液比1∶8加入800 mL蒸餾水回流提取1 h，冷卻后過濾并合并兩次濾液，蒸發濃縮至恒定體積，4 ℃冷藏備用。

1.2.2 動物分組及給藥 取60只小鼠按體重隨機分為空白對照組、模型組、聯苯雙酯滴丸組（0.15 g/kg）、蟬蛻水提取物的低、中、高（0.60、0.75、0.90 g/kg）劑量組共6組，每組10只。每組小鼠均按每千克體重劑量灌胃給藥，空白對照組和模型組每天給予等體積的生理鹽水，每天給藥1次，連續給藥13 d。

1.2.3 D-GaIN急性肝損傷模型的建立 給藥前將D-GaIN碾碎溶解并配制成10%生理鹽水溶液，加入1 mol/L NaOH調pH至7.0。造模各組小鼠末次給藥12 h后，按600 mg/kg腹腔注射10% D-GaIN溶液[7]； 空白對照組給予等體積的生理鹽水。小鼠禁食不禁水，末次給藥24 h后再次稱重，小鼠眼球采血，處死小鼠后迅速取出肝臟及心臟組織。

1.2.4 生化指標的測定 小鼠眼球取血后3 000 r/min離心10 min，取血清冷藏備用，按相應試劑盒說明分別測定血清中ALT和AST活性。取肝左葉0.6～0.8 g按質量比1∶9加入預冷的生理鹽水勻漿制備10%的組織勻漿，以3 500 r/min離心10 min，取上清液冷藏保存，按試劑盒說明分別測定小鼠肝組織及心肌組織中的SOD活性、MDA含量。

1.2.5 病理組織學檢查 用10%的甲醛溶液固定小鼠肝右葉，石蠟包埋，切片后用常規HE染色制片，在光鏡下觀察肝組織結構變化及細胞形態學的改變。

1.2.6 統計學數據處理 試驗數據采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，結果用x±S表示，應用單因素方差分析及t檢驗進行比較，P<0.05時則表示該差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 各組小鼠體重與肝臟指數

由表1可以看出，與空白對照組比較，各組小鼠體質量未見明顯差異，表明蟬蛻水提取物在試驗條件下對動物的體重無明顯影響。與模型組比較，各組小鼠肝指數降低（P<0.01或P<0.05）。

2.2 各組小鼠血清AST、ALT水平

由表2可以看出，與空白對照組比較，模型組小鼠血清中的AST和ALT活性極顯著升高（P<0.01），表明小鼠急性肝損傷模型造模成功。與模型組比較，聯苯雙酯滴丸、蟬蛻水提取物的低、中、高劑量組小鼠血清中的AST和ALT活性下降（P<0.01或P<0.05）。

2.3 各組小鼠心肌組織SOD、MDA水平

由表3可以看出，與空白對照組比較，模型組小鼠心肌組織的SOD活性降低、MDA含量上升（P<0.01）。與模型組比較，聯苯雙酯滴丸、蟬蛻水提取物的低、中、高劑量組小鼠心肌組織的SOD活性上升（P<0.01），MDA含量降低（P<0.01或P<0.05）。

2.4 各組小鼠肝臟組織SOD、MDA水平

由表4可以看出，與空白對照組比較，模型組小鼠肝臟組織的SOD活性降低、MDA含量上升（P<0.01）。與模型組比較，聯苯雙酯滴丸、蟬蛻水提取物的低、中、高劑量組小鼠肝臟組織的SOD活性上升（P<0.01或P<0.05），MDA含量降低（P<0.01或P<0.05）。

2.5 各組小鼠肝組織病理形態學變化比較

由圖1可以看出，空白對照組肝組織結構及肝細胞正常，無溶解及壞死；模型組的肝細胞呈彌漫性水腫，胞漿腫脹透亮、疏松，肝細胞核溶解、壞死及消失，病變以小葉中央靜脈周圍的肝細胞為重；聯苯雙酯滴丸組的肝小葉結構大致正常，無肝細胞變性壞死，再生細胞較少；與模型組比較，蟬蛻水提取物治療組肝細胞形態明顯好轉，肝細胞溶解、壞死明顯減少，并伴有少量肝細胞再生，特別中劑量組改善最明顯。

3 小結與討論

研究證實，D-GaIN誘導的急性肝損傷與病毒性肝炎相似，能直接或間接地誘導生物膜系統發生脂質過氧化，同時可破壞肝細胞膜結構和功能完整性，是目前最接近人類臨床病毒性肝炎病理變化的理想模型[8，9]。

肝細胞內含有AST與ALT，一般情況下血液中僅含少量，但是當肝細胞裂解壞死時，AST與ALT則大量進入血液系統循環。因此，通過測定血清中的AST與ALT含量能有效地反映肝細胞變性程度[10]。SOD具有催化超氧陰離子自由基發生歧化反應的性質，可作為超氧陰離子自由基的清除劑，可防止細胞損傷，同時SOD在哺乳動物體內與其壽命長短有較重要的關系，因此其含量的變化可以用來反映細胞的抗氧化能力，即損傷程度[10，11]、抗衰老能力[6，8]。MDA是細胞膜脂質過氧化的終產物之一，具有較強毒性，可導致細胞裂解壞死，破壞蛋白和酶的結構和功能，因此可以用MDA含量來間接評價組織脂質過氧化程度[12，13]。

本研究中模型組小鼠血清中ALT、AST含量明顯升高，肝臟指數增加，表明D-GalN模型復制成功，而小鼠肝臟、心肌組織中SOD活性降低，MDA含量增高，提示模型組小鼠體內有氧化應激反應的發生。病理形態學顯示肝細胞受損嚴重，表明脂質過氧化增強導致肝細胞損傷。通過蟬蛻水提取物治療后，能明顯降低D-GalN誘導的小鼠急性肝損傷血清中ALT、AST水平，增強小鼠肝臟、心肌組織中SDO活性，降低MDA含量，同時還明顯減輕肝組織炎癥病變程度。由此提示，蟬蛻水提取物可能通過催化超氧陰離子自由基發生歧化，降低肝細胞、心肌細胞內氧化脂質的水平，促進氧自由基的清除，提高機體的抗氧化來保護肝細胞的損害。蟬蛻水提取物對D-GalN誘導的小鼠急性肝損傷有一定的保護作用，推測其機制可能與減輕脂質過氧化、清除自由基、提高機體的抗氧化、保護肝細胞膜等有關。

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