降解石榴皮單寧菌株的篩選及鑒定

楊露+張曉麗+高迪+李欣宇+張立華

摘要：旨在分離、篩選出可降解石榴（Punica granatum L.）皮單寧的微生物，從自然條件下霉變的石榴皮上挑取野生菌株劃線分離，獲得純種菌株，使用含單寧酸的溴酚藍培養基初篩，再經含石榴單寧的液體培養基復篩。結果篩選出5株野生菌株，依次編號為1#～5#，其中3#和5#菌株的生物耗氧量（COD）去除率分別為60.7%和54.8%，經形態學觀察初步鑒定這2株菌株同屬于黑曲霉（Aspergillus niger）。

關鍵詞：石榴（Punica granatum L.）皮單寧；黑曲霉（Aspergillus niger）；篩選；鑒定

中圖分類號：S665.4 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）12-2266-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.12.016

Screening and Identification of the Pomegranate Husk Tannin-degrading Strains

YANG Lu， ZHANG Xiao-li， GAO Di， LI Xin-yu， ZHANG Li-hua

（College of Life Science， Zaozhuang University， Zaozhuang 277160，Shandong，China）

Abstract： In order to isolate the microorganisms which could degrade the tannin from pomegranate（Punica granatum L.） husk，the pure strains were obtained by using pomegranate husk as the culture medium after separating and puring. Then the strains were cultured on the plate that bromophenol blue and tannin acid were added to，and continually cultured in the liquid culture medium containing pomegranate tannin. The results showed that 5 strains numbered 1#～5# were screened，and the COD removal rate of 3# and 5# strain was 60.7% and 54.8%，respectively. The 2 strains were identified by morphological method，which belonged to Aspergillus niger.

Key words： tannin of pomegranate（Punica granatum L.） husk； Aspergillus niger； screening； identification

石榴（Punica granatum L.）為石榴科石榴屬落葉灌木或小喬木，又名安石榴。原產于伊朗、阿富汗等中亞一帶，自西漢張騫出使西域引入中國。石榴適宜栽植范圍較廣，在中國除極寒地區外有20多個省市自治區均有栽培，已形成了云南蒙自、四川會理、山東棗莊、陜西臨潼、新疆葉城、河南滎陽、安徽懷遠等石榴主產區[1]。

石榴是一種藥食兩用植物，其根、葉、花、果實、果皮、種子均可入藥，全身是寶[2，3]，其中，石榴皮有多種藥用價值，其提取物對蟾蜍在體心率和心肌收縮力方面均有抑制作用[4]，對大鼠實驗性胃潰瘍有保護作用[5]；石榴皮具有一定的抗菌作用[6]、抗病毒作用[7]；藥理試驗結果表明石榴皮提取物具有一定的抗前列腺癌、皮膚癌、結腸癌和乳腺癌的作用[8，9]。石榴皮中的多酚類化合物是其主要的功效成分[10，11]。多酚類物質在石榴皮中含量豐富[12]，石榴多酚主要包括簡單的酚酸和聚合態的單寧[13]，簡單酚酸如沒食子酸、鞣花酸、兒茶酚等，石榴皮中游離態的酚酸含量較少，多以單寧形式存在，單寧亦稱鞣質，又以鞣花單寧為主，鞣花單寧在一定條件下可以水解為鞣花酸，研究表明鞣花酸具有顯著的藥理活性，被廣泛用于醫藥、化妝品及食品領域[14，15]。目前從石榴皮中制取鞣花酸多采用加熱酸解的方式[16]，該方式能耗高、污染重。據報道有些微生物能降解植物單寧產生鞣花酸，有人采用多菌種共培養降解橡椀單寧制備鞣花酸[17]，但鮮見生物降解石榴皮單寧制取鞣花酸的報道。本研究旨在分離自然條件下發酵石榴皮的菌株，經過初篩、復篩篩選出可降解石榴皮單寧的菌株，并對其鑒定，為后期石榴皮單寧酶的研究以及石榴皮的微生物發酵制取鞣花酸奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

石榴皮，石榴品種為大青皮，產自山東棗莊。

1.2 培養基

PDA培養基：馬鈴薯汁1 000 mL、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，121 ℃滅菌30 min。馬鈴薯汁制備：馬鈴薯去皮、洗凈、切片。稱取200 g放入1 000 mL去離子水中煮沸30 min，雙層紗布過濾，濾液加水補至 1 000 mL。

0.5%單寧酸篩選培養基[14]：KH2PO4 4.38 g/L、（NH4）2SO4 8.76 g/L、CaCl2 88.00 mg/L、MgSO4·7H2O 880.00 mg/L、MnCl2·6H2O 18.00 mg/L、NaMoO4·2H2O 8.80 mg/L、FeSO4·7H2O 120.00 mg/L、溴酚蘭40.00 mg/L、瓊脂20.00 g/L、單寧酸5.00 g/L，過濾除菌（濾膜直徑25 mm孔徑0.45 μm），pH 5.5，121 ℃滅菌15 min。

0.5%石榴皮單寧發酵培養基[18]：葡萄糖10.00 g/L、NaNO3 3.00 g/L、KCl 0.50 g/L、KH2PO4 1.00 g/L、MgSO4·7H2O 0.50 g/L、FeSO4·7H2O 2.50 mg/L，121 ℃滅菌20 min。其中石榴皮單寧由石榴皮為原料提取制備。

1.3 野生菌株的獲得與COD測定方法

新鮮石榴皮在30 ℃潮濕環境中自然霉變，4 d后劃線分離。

1.3.1 分離與純化 挑取菌株，在PDA培養基上劃線，30 ℃培養，3 d后重復以上操作，直至得到純菌株。

1.3.2 初篩 將純化的菌種接種到溴酚藍單寧酸篩選培養基上，30 ℃恒溫培養3 d，觀察菌落生長狀況及菌落邊緣顏色變化。

1.3.3 復篩 將初篩得到的菌株分別接種于含0.5%石榴單寧發酵培養基的三角瓶中，以未接菌種的培養基作為對照，與上述培養液在相同條件下160 r/min、30 ℃搖床中培養4 d。對培養液的生物耗氧量（COD）進行測定，采用重鉻酸鉀法測定COD[19]。按式（1）計算COD去除率，以此作為菌株降解單寧能力的指標，篩選出較高COD去除率的菌株。

COD去除率=

■×100%（1）

1.4 菌株的鑒定

1.4.1 菌落特征的觀察 挑取菌絲點接種于PDA平板培養基上，在培養箱中30 ℃倒置培養，分別觀察培養48、72、96 h菌落的形態，并拍照記錄。

1.4.2 細胞形態的觀察 采用溫室培養法臨時裝片，在顯微鏡下觀察菌株菌絲和孢子的特征，并拍照記錄。

2 結果與分析

2.1 野生菌株的獲得

2.1.1 分離與純化 在0.5%單寧酸篩選培養基上接種分離，得到9株純化菌株。

2.1.2 初篩結果 沒食子酸為單寧酸分解后的產物之一，可以使溴酚藍由藍紫色變為黃色。能產生單寧酶的菌株在加入溴酚藍培養基中生長，降解產物沒食子酸可以使培養基顏色由藍紫色變為黃色（圖1），以此來初步判斷菌株降解單寧的能力。

將9株純化菌株于30 ℃培養4 d，觀察菌落周圍的變色情況，據此判斷各菌株分解單寧的能力。其中，5株菌株分解單寧能力較強，依次編號為1#～5#，均采用斜面培養保存。

2.1.3 復篩結果 將初篩得到的5株菌株分別接種于0.5%石榴皮單寧發酵培養基中，測定菌株的COD，并計算COD去除率。由圖2可知，3#和5#菌株的COD去除率分別為60.7%和54.8%，明顯高于其他菌株，作為優質目的菌株，命名為Pomegranate pericarp-3（PP-3）、Pomegranate pericarp-5（PP-5）。并對PP-3、PP-5進行形態學鑒定。

2.2 菌株的鑒定

將PP-3菌株接種于PDA平板培養基中培養96 h，分別選取培養48、72、96 h的菌落進行形態觀察，其形態見圖3。顯微鏡下觀察3#菌株的菌絲和孢子，其形態見圖4。3#菌株的菌落形狀呈球形，初為白色，后變為黑色顆粒狀，背面略帶黃色，質地為厚絨狀，表面平坦，具同心輪。顯微鏡下觀察，菌絲多核，有橫隔，有足細胞，分生孢子梗長，梗基無橫隔，表面光滑，孢子頭粗糙，呈放射狀，頂囊球形，表面有2列小梗，分生孢子球形，串生。根據魏景超[20]的鑒定方法，初步鑒定該菌株屬于半知菌類（不完全菌）（Fungi Im-perfecti）從梗孢科（Moniliaceae）黑曲霉（Aspergillus niger）。

將PP-5菌株接種于PDA平板培養基中培養96 h，選取培養48、72、96 h的菌落進行形態觀察，其形態見圖5。顯微鏡下觀察5#菌株的菌絲和孢子，其形態見圖6。5#菌株的菌落形狀呈球形，初為白色，后變為黑色顆粒狀，背面白色，質地為厚絨狀，中心凸起，具同心輪。顯微鏡下觀察，菌絲具橫隔，具足細胞，分生孢子梗長，梗基無橫隔，表面光滑，孢子頭粗糙，呈放射狀，頂囊球形，表面有2列小梗，分生孢子球形，串生。根據魏景超[20]的鑒定方法，初步鑒定該菌株屬于半知菌類（不完全菌）從梗孢科黑曲霉。

3 小結與討論

單寧是高等植物的次生代謝產物，是結構復雜的多酚類化合物，易與蛋白質包括酶蛋白結合形成難溶于水的復合物，從而抑制酶活性降低機體代謝，具有廣泛的抑菌效果。因此，只有能夠產單寧酶的微生物才能在富含單寧的培養基上生長。該試驗以石榴單寧為營養物，獲得對石榴單寧有抗性的菌株，并對其進行形態學鑒定。

單寧的某些降解產物能與溴酚藍發生顏色反應，因此，可以通過觀察培養基上菌落周圍的顏色變化對具備單寧降解能力的微生物進行初篩[21]。對于好氧微生物發酵，底物的降解率、產物的生成量和COD去除率都可以作為反映微生物對底物降解能力的指標[22]。由于培養液為成分復雜的混合物，底物與產物的測定相對困難，COD的檢測更為簡便，且其去除率能夠準確地反映微生物降解石榴單寧的能力，可以用COD去除率來代表微生物對單寧的降解率。喬家運等[23]從霉變的葡萄上分離出的單寧降解菌—黑曲霉SL-5COD去除率為49.4%，欒麗杰等[24]篩選出能分解澀柿單寧的黑曲霉COD去除率為43.2%，本研究經初篩和復篩，篩選出能夠有效降解石榴單寧的2株菌株PP-3和PP-5，COD去除率分別為60.7%和54.8%，表明這2株黑曲霉對石榴單寧的降解能力較強，有望成為降解石榴皮渣的工程菌株。

傳統的形態學鑒定具有較高的準確性和穩定性，且簡便經濟，是仍被廣泛使用的菌類鑒定方法[25]。本研究所分離菌株的菌落、菌絲及孢子形態特征明顯，因此也選用傳統的形態學方法對菌株進行了鑒定，雖然PP-3和PP-5菌落、孢子囊形態有一定的差別，但都具備黑曲霉的共同特征，初步推斷兩菌株均為黑曲霉。

石榴果汁加工企業會產生大量石榴皮渣，多被廢棄，造成資源浪費。化學降解石榴皮單寧制取鞣花酸因能耗高、污染重，其應用受到限制[26]。后續研究將通過基因工程技術改造菌種進一步提高降解單寧的能力，以及優化菌種的發酵條件，以期將目的菌株用于工業處理石榴皮渣生產相關酶類及鞣花酸等降解產物。

參考文獻：

[1] 張海峰，白 杰，張 英.我國石榴資源及其開發利用的研究進展[J].飲料工業，2009，12（8）：1-3.

[2] 張立華，郝兆祥，董業成.石榴的功能成分及開發利用[J].山東農業科學，2015，47（10）：133-138.

[3] 馬 齊，秦 濤，王麗娥，等.石榴的營養成分及應用研究現狀[J].食品工業科技，2007，28（2）：237-238，241.

[4] 祝建平，劉 瑜，張立盈，等.石榴皮水提物對中華大蟾蜍心電活動的影響[J].食品與藥品，2009，11（9）：22-25.

[5] 史李娜，王雪飛，馬桂芝，等.石榴皮多酚有效部位單次給藥毒性及對無水乙醇致大鼠胃潰瘍的保護作用[J].中國藥理學通報，2015，31（5）：709-715.

[6] 陸雪瑩，熱依木古麗·阿布都拉，李艷紅，等.新疆石榴皮總多酚有效部位的抗氧化、抗菌及抗腫瘤活性[J].食品科學，2012， 33（9）：26-30.

[7] 陳 艷，金永芬，沈國方.石榴皮輔助治療嬰幼兒急性輪狀病毒腹瀉的效果[J].中國鄉村醫藥，2013，20（17）：36-37.

[8] 姜 婧，高曉黎，馬桂芝，等.石榴主要成分的抗腫瘤研究進展[J].農墾醫學，2010，32（3）：259-262.

[9] 張玉梅，王家曉.石榴皮鞣花酸對4T1乳腺癌小鼠免疫功能的影響[J].現代中西醫結合雜志，2014，23（15）：1597-1599，1602.

[10] 周本宏，周 靜，梁藝小，等.石榴皮鞣質改善大鼠腎纖維化作用研究[J].中草藥，2014，45（11）：1585-1590.

[11] 張曉玲，朱明芳，楊 柳，等.石榴皮多酚對痤瘡丙酸桿菌體外抑菌活性的研究[J].湖南中醫藥大學學報，2015，35（9）：23-25.

[12] 馬倩倩，李建科，于 振，等.石榴皮多酚生物學活性的研究進展[J].食品工業科技，2013，34（6）：363-366.

[13] 蒲 博，李 兵，楊舒慧，等.石榴皮多酚分離純化及對脂肪酸合成酶抑制作用的研究[J].食品科學，2014，35（17）：99-103.

[14] 丁 楠，高曉黎.HPLC法測定石榴皮提取物中鞣花酸的含量[J].新疆醫科大學學報，2012，35（6）：770-772.

[15] 張玉梅，王家曉.石榴皮鞣花酸抑制乳腺癌機制研究[J].吉林中醫藥，2014，34（7）：720-723.

[16] LU J J，YUAN Q P. A new method for ellagic acid production from pomegranate husk[J].Journal of Food Process Engineering，2008，31（4）：443-454.

[17] 黃 文，石 壁，李 慶，等.利用多菌種共培養降解橡單寧制備鞣花酸[J].林產化學與工業，2002，21（1）：21-24.

[18] 欒麗杰.分泌澀柿單寧酶的微生物篩選及其酶特性的研究[D].西安：陜西師范大學，2007.

[19] GB 11914-1989，水質化學需氧量的測定 重鉻酸鹽法[S].

[20] 魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海：科學技術出版社，1979.

[21] 郭魯宏.單寧酶的制備及酶法制取沒食子酸及其丙酯研究[D].沈陽：中國科學院沈陽應用生態研究所，1999.

[22] 黃 文.橡椀單寧生物降解及其機理研究[D].成都：四川大學，2002.

[23] 喬家運，李 平，陳龍賓，等.單寧降解菌的篩選及降解研究[J].飼料工業，2011，32（5）：28-29.

[24] 欒麗杰，楊永濤.產澀柿單寧酶菌株的篩選及鑒定[J].安徽農業科學，2010，38（20）：10499-10501.

[25] 姚 粟，李 輝，程 池.23株曲霉屬菌種的形態學復核鑒定研究[J].食品與發酵工業，2006，32（12）：37-43.

[26] 鄧小莉，董翠月，吳羽晨，等.不同提取方法對石榴皮鞣花酸提取率的影響[J].云南農業大學學報，2015，30（6）：969-973.