芽孢桿菌NY3的鑒定及其對雞毛菜的促生效果

邢芳芳+高明夫+胡兆平+范玲超

摘要：在形態分類的基礎上，結合分子鑒定手段對芽孢桿菌NY3進行分類鑒定；并將芽孢桿菌NY3進行液體發酵培養，在溫室條件下，研究NY3菌株對雞毛菜（Brassica chinensis）的促生效果。依據NY3的培養性狀、顯微特征描述和系統發育分析，顯示菌株NY3屬于蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）；在溫室盆栽試驗中，添加NY3菌劑的各處理生物量、葉綠素均比CK增加，其中，添加1.0 mL（T3，有機無機復混肥+ NY3菌劑1.0 mL，含芽孢桿菌1.0×109 CFU）增產最高，鮮重、干重比對照組分別提高20.28%、14.34%。

關鍵詞：形態特征；分子鑒定；促生效果；蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）

中圖分類號：S476 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）12-2239-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.12.011

Identification of Bacillus spp. NY3 and Its Growth Promoting

Effect on Brassica chinensis

XING Fang-fang， GAO Ming-fu， HU Zhao-ping， FAN Ling-chao

（Kingenta Ecological Engineering Group Co.，Ltd./State Key Laboratory of Nutrition Resources Integrated Utilization，Linyi 276700，Shandong，China）

Abstract： NY3 was classified and identified by combining morphological classification with molecular identification means. After fermentation of Bacillus spp. NY3， under the condition of the greenhouse，the growth promoting effect of NY3 on Brassica chinensis was researched. According to the description of culture characters and microscopic characteristics of NY3， combining molecular identification， the strain NY3 was identified as B. cereus. NY3 has obvious effect on promoting growth of B. chinensis， the adding of 1 mL（T3，Organic inorganic fertilizer+NY3 bacterial agent 1.0 mL） NY3 agents had the best effect on increasing the biological yield and SPAD significantly， which contained 1.0×109 CFU/mL spores of NY3. Compared with CK， fresh weight and dry weight of T3 was increased by 20.28% and 14.34%， respectively.

Key words： morphologic character； molecular identification； growth promoting effect； Bacillus cereus

芽孢桿菌是一類需氧或兼性厭氧的革蘭氏陽性細菌（目前也發現有革蘭氏陰性），因其抗逆性強、繁殖速度快、易于生產、定殖等特點，被廣泛應用于生物肥料的研究與生產中。芽孢桿菌在自然界分布廣泛，生理特性豐富多樣，是土壤和植物微生態優勢種群之一。它可以產生抗菌肽類物質，對根腐病、立枯絲核病等多種病原菌均能起到很好的抑制作用[1]。蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）是芽孢桿菌的一種，其芽孢對高溫、干旱、鹽脅迫等極端環境有較強的抵抗能力，當環境條件適宜時，芽孢迅速萌發，在環境條件較惡劣時，芽孢快速形成，進入休眠狀態。蠟樣芽孢桿菌具有促進植物生長、提高作物產量、抑制作物病害的功能，部分蠟樣芽孢桿菌還具有抑菌和殺蟲作用。蠟樣芽孢桿菌在繁殖、代謝過程中可以產生多種具有抑菌、殺菌活性的代謝產物，能夠抑制有害微生物的繁殖，抑制鐮刀菌、立枯絲核菌等病原真菌[2，3]。菌體代謝過程中還能分泌蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等多種活性酶類，能夠降解土壤中的有機物，改善生態環境，促進作物生長。蠟樣芽孢桿菌的芽孢具有較強的耐熱、耐鹽等抗逆性，在發酵工藝、劑型加工、貨架期、定殖能力等方面與其他芽孢桿菌相比具有無可比擬的優勢。蠟樣芽孢桿菌因其獨特的功能特性，已經被廣泛應用于農業、醫藥、畜牧業等領域[4，5]。

本研究對實驗室保藏的一株篩分自健康、高產番茄根際土壤的芽孢桿菌NY3進行了鑒定，并將菌株NY3進行液體發酵制備菌劑，通過盆栽試驗研究活體菌劑對雞毛菜生長季產量的影響，為該芽孢桿菌劑的進一步推廣提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 芽孢桿菌NY3保藏于金正大生態工程集團股份有限公司菌種保藏室，篩分自山東省臨沂市大棚健康、高產番茄根際土壤。

1.1.2 培養基 牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂18.0 g，去離子水1 000 mL，pH 7.0～7.2，105 Pa滅菌30 min；蠟樣芽孢桿菌選擇培養基：稱取甘露醇卵黃多黏菌素瓊脂基礎（MYP，青島海博生物技術有限公司）4.6 g，加熱溶解于100 mL去離子水中，經121 ℃高壓滅菌15 min，待培養基冷卻至50 ℃時，每瓶加入50%卵黃乳液5 mL及多黏菌素B 10 000 IU，搖勻，傾入無菌平皿；種子培養基[6]：胰蛋白胨8.0 g，酵母提取物5.0 g，葡萄糖10.0 g，NaCl 5.0 g，去離子水1 000 mL，pH 7.0，分裝于300 mL三角燒瓶，每瓶50 mL，105 Pa滅菌15 min；菌株發酵培養基[6]：玉米淀粉2.0 g，黃豆餅粉5.0 g，酵母粉0.55 g、K2HPO4 0.03 g，MgSO4·7H2O 0.02 g，CaCO3 0.05 g，ZnSO4 0.02 g，去離子水100 mL，pH 7.2，裝入500 mL三角燒瓶中，105 Pa滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 芽孢桿菌NY3形態觀察 將斜面上保藏的NY3接種到MYP培養基平板上，37 ℃培養24 h，用于觀察菌落和菌體的形態特征。

1.2.2 菌株NY3的活化 取冰箱保存的試管斜面，劃線活化于牛肉膏蛋白胨培養基平板，置于37 ℃生化培養箱中倒置培養，連續傳代兩次即得到活化菌株。

1.2.3 菌株NY3制劑的制備 挑取活化后的健壯NY3菌落接種于種子培養基中，35 ℃、200 r/min條件下搖床培養18 h后，按照10%接種量接種于發酵培養基中，每瓶發酵培養基接種10 mL，200 r/min搖床培養32 h，即得NY3發酵液。離心發酵液得上清液和菌體沉淀，將菌體沉淀用去離子水配成含有109 CFU/mL的NY3菌劑[7]。

1.2.4 NY3分子生物學鑒定 NY3 16S rDNA PCR擴增參考謝永麗等[8]的方法。將NY3活化菌株接入種子培養基中，裝瓶量為70 mL/300 mL，于37 ℃、200 r/min培養24 h，離心收集菌體，并用滅菌濾紙吸干多余水分，利用Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒（生工生物工程（上海）股份有限公司），提取NY3基因組，擴增引物分別為16S rDNA通用引物27F：5′-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，PCR反應體系：10×Buffer 2.5 μL，dNTP 1.0 μL，引物27F 0.5 μL，1492R 0.5 μL，Taq酶0.2 μL，G1基因組0.5 μL，加無菌水至25 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性35 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 min，共25個循環，72 ℃延伸10 min，4 ℃終止反應。由生工生物工程（上海）股份有限公司對PCR產物測序。將測得的16S rDNA序列與GenBank數據庫中相似性高的相關菌株的16S rDNA序列進行比對[9]。

1.2.5 雞毛菜盆栽試驗 于2016年1月9日至2月18日在金正大生態工程集團股份有限公司的智能玻璃溫室中進行。

供試雞毛菜（Brassica chinensis），在本地種子站購得，為本地常用品種；供試底肥為山東泉林嘉有肥料有限責任公司生產的黃腐酸有機無機復混肥（13-13-5），有機質≥150 g/kg，黃腐酸≥80 g/kg。NY3芽孢桿菌劑為芽孢桿菌數為1.0×109 CFU/mL的活菌制劑；供試土壤為棕壤，有機質含量為12.6 g/kg。

設4個處理，每個處理4個重復，每盆裝土2 kg，有機無機復混肥的施用量為750 kg/hm2，全部肥料作為基肥一次性施入。CK為對照，不施用菌劑；處理組為使用不同用量的菌劑，處理1（T1）添加NY3菌劑0.1 mL（含芽孢桿菌1.0×108 CFU）；處理2（T2）添加NY3菌劑0.5 mL（含芽孢桿菌5.0×108 CFU），處理3（T3）添加NY3菌劑1.0 mL（含芽孢桿菌1.0×109 CFU），每盆播種10株以上的雞毛菜種子。待雞毛菜長出2片真葉后間苗定植，每盆1株，于收獲時測定鮮重、葉綠素和葉片數，烘干后稱干重。

1.2.6 葉片數、生理指標測定 葉片數只選擇綠色可食用部分；葉綠素含量測定采用SPAD-502Plus型葉綠素測定儀進行；干重測定按常規方法進行[10，11]。

1.2.7 數據分析 試驗數據采用Excel進行處理，利用SPSS 16.0軟件進行數據統計及差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 NY3菌株的形態觀察

NY3菌落在MYP培養基上生長良好，菌落為粉紅色，周圍有粉紅色暈圈，表面粗糙似融蠟狀，不透明（圖1，左）；通過光學顯微鏡觀察芽孢形態，芽孢呈鏈狀排列，圓形或橢圓形，直徑1.0～1.5 μm，革蘭氏染色呈陽性（圖1，右）。

2.2 菌株16S rDNA基因序列擴增與測序

PCR擴增片段電泳結果如圖2所示，芽孢桿菌NY3 16S rDNA基因序列擴增后片段長度為1 449 bp。

由圖3可知，芽孢桿菌NY3與蠟樣芽孢桿菌ATCC 14579同源性最高，匹配程度可達到100%，結合菌株形態及顯微鏡觀察，確定NY3為蠟樣芽孢桿菌。

2.3 芽孢桿菌NY3對葉綠素含量、雞毛菜葉片數的影響

由圖4可知，與CK相比，施用菌劑的各處理均提高了雞毛菜葉片中葉綠素含量，差異均不顯著。其中，添加NY3菌劑0.1 mL（T1）的雞毛菜葉片葉綠素含量提高1.93%，添加NY3菌劑0.5 mL（T2）葉綠素含量提高3.18%，添加NY3菌劑1.0 mL（T3）葉綠素含量提高3.66%。就葉片數而言，與CK相比，各處理均提高了雞毛菜葉片數。其中，T1較CK葉片數增加2.78%，T2較CK葉片數增加5.56%，T3較CK葉片數增加6.94%，T2、T3與CK相比差異顯著。表明在施加有機無機復混肥為底肥的情況下每盆施用0.1×108～1.0×109 CFU的蠟樣芽孢桿菌NY3活體可以提高葉綠素含量，增加葉片數，其中，T2、T3與CK相比對葉片數有顯著增加作用。

2.4 芽孢桿菌NY3對雞毛菜鮮重、干重的影響

由表1可知，與CK相比，添加NY3菌劑的處理鮮重增加3.51～7.78 g，干重增加0.05～0.44 g。其中，添加NY3菌劑0.1 mL（T1）較對照（CK）鮮重增加9.15%，干重增加1.64%，添加NY3菌劑0.5 mL（T2）較CK鮮重增加15.66%，干重增加11.15%，添加NY3菌劑1.0 mL（T3）增產最高，較CK鮮重增加20.28%，干重增加14.43%。表明在施加有機無機復混肥的基礎上增施蠟樣芽孢桿菌NY3菌劑，可增加雞毛菜的鮮重和干重，且每盆增施蠟樣芽孢桿菌0.5×109～1.0×109 CFU NY3活體芽孢，可極顯著增加雞毛菜的鮮重和干重。

3 小結與討論

通過分子生物學鑒定，結合形態觀察，確定NY3菌株為蠟樣芽孢桿菌。

對蠟樣芽孢桿菌NY3進行促生效果評價，施加NY3菌劑0.1、0.5、1.0 mL，對雞毛菜的生長均起到了促進作用，提高了其對水分的吸收、干物質的積累以及葉片葉綠素含量。其中，添加NY3菌劑1.0 mL（T3）較CK鮮重提高20.28%，干重提高14.43%。表明蠟樣芽孢桿菌NY3對雞毛菜的生長有明顯的促進作用，有效活菌數越高對雞毛菜的促生效果越明顯。但在提高葉綠素含量方面差異不明顯，而添加NY3菌劑0.5～1.0 mL能顯著增加雞毛菜葉片數。

芽孢桿菌作為一種資源豐富的微生物類群，具有廣譜的植物病害防治、促進作物生長、誘導植物抗性等作用，已發現有芽孢桿菌菌株能有效促進植物的生長和發育，提高植物產量。芽孢桿菌能賦予宿主植物耐受非生物脅迫的能力，并在緩解強脅迫的環境壓力，如干旱、鹽堿、低溫以及重金屬污染等發面發揮重要作用。目前，微生物菌劑作用的穩定性常受到外界環境的影響，尤其是田間降水、溫度、土壤pH以及土壤微環境等，均會對微生物菌劑作用的發揮帶來影響。因此，后續試驗還需在不同土壤環境和不同氣候的條件下，對蠟樣芽孢桿菌NY3的促生效果進行研究和驗證，為其開發成良好的農用微生物菌劑奠定基礎。

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