蛋白同化雄性類固醇檢測技術研究進展

李國俊

摘 要：蛋白同化雄性類固醇是一類濫用最為普遍的禁用物質， 對其進行有效的控制和檢測關系到運動員的身心健康和體育比賽的公平公正。對該類禁用物質分析方法的改進和發展是目前興奮劑檢測的重要任務。該文通過對蛋白同化雄性類固醇使用現狀的分析，結合里約奧運會類固醇檢測技術的研究分析和近兩年在國內外期刊發表的有關類固醇檢測方面的文獻進行歸納總結，以為相關機構開展有關研究提供借鑒依據。

關鍵詞：蛋白同化雄性類固醇 檢測 長效代謝物

中圖分類號：R87 文獻標識碼：A 文章編號：1672-3791（2017）06（a）-0252-02

1 蛋白同化雄性類固醇在體育領域使用現狀分析

蛋白同化雄性類固醇具有三個特點，一是具有蛋白同化的生理活性，其蛋白同化作用可以增加蛋白質合成， 促進肌肉增長和紅細胞生成， 增強力量和耐力；二是屬于雄性激素，而雄性激素作用可以使男性性特征更加明顯；三是該類物質從化學結構性質上屬于類固醇，它是廣泛分布于生物界的一大類環戊稠環全氫化菲衍生物的總稱， 又稱甾醇、甾族化合物。

20世紀50年代，前蘇聯舉重運動員開始通過服用雄性激素睪酮增加力量。到20世紀60年代，競技運動員使用類固醇激素的現象已非常普遍，因而國際奧林匹克委員會（IOC）將這類物質判定為興奮劑而明令禁止。目前，在所有禁用物質當中，蛋白同化雄性類固醇仍然是濫用最為普遍的物質，在世界反興奮劑機構“2015 Anti-Doping Testing Figures”可以看出， 2015年世界反興奮劑機構認可的興奮劑檢測實驗室所提供的陽性物質統計中，蛋白同化雄性類固醇陽性率仍然達到50%～60%。國際舉重聯合會公布國際奧委會復檢北京、倫敦奧運會樣品陽性結果，大多涉及類固醇的長效代謝物。

類固醇類興奮劑的濫用嚴重影響到體育比賽的公平、公正性， 且長期使用這類興奮劑會嚴重干擾人體的自然激素平衡， 導致異性化現象，男性運動員使用會出現胸部增大，睪丸縮小，女性化特征明顯，而女性運動員使用會出現喉結，體毛加重，痤瘡等男性化特征，甚至可能引起嚴重的肝、腎損傷， 并發肝癌、心臟病， 并產生藥物依賴， 少數人還可能出現嚴重的情感及精神病癥。

在世界反興奮劑機構《2016年禁用清單國際標準》中，蛋白同化雄性類固醇分為兩類，一是外源性蛋白同化雄性類固醇，如氯司替勃、去氫氯甲睪酮、美雄酮等。另一類是外源性攝入內源性蛋白同化雄性類固醇，代表物質包括雙氫睪酮、普拉睪酮、睪酮等。內源性蛋白同化雄性類固醇是指人體自身能夠分泌，外源性是指人體自身不能分泌而經人工合成的。

2 類固醇常規分析方法

目前國際奧委會（IOC）規定的蛋白同化雄性類固醇類物質的標準分析方法是采用氣相色譜-質譜（GC-MS）方法分析尿樣， 選擇特定的特征離子進行監測。尿樣一般先經酶解除去蛋白質等生物大分子， 之后經固相萃取或液-液萃取對目標物質進行初步的分離富集， 將得到的被分析物進行三甲基硅烷化衍生后即可進入毛細管氣相色譜分析， 常通過四極桿質譜監測特征離子。這類方法對絕大多數外源性雄性類固醇能夠獲得比較可靠的分析結果。

3 外源性類固醇的檢測進展

對于判斷運動員是否使用了外源性類固醇激素， 需要檢測尿液中是否存在該物質或其代謝物或標記物即可。目前，在外源性類固醇的檢測方面，主要的研究進展是使用高分辨靜電場軌道離子阱技術發現一些運動員經常使用的類固醇類藥物的長效代謝物，使檢測窗口期延長，提高陽性檢出率。下面就里約奧運會類固醇檢測技術以及近兩年在國內外發表的類固醇檢測技術的期刊內容進行統計。

在Loanna Athanasiadou [1]研究表明，通過長效代謝物的發現，使得里約奧運會類固醇檢測窗口期大大延長。如司坦唑醇通過檢測它在尿液中的代謝物17-表司坦唑醇-N-葡萄糖甙，使得該物質檢測窗口期延長到停藥25 d左右；對于去氫氯甲睪酮，發現了它的代謝物去氫氯甲睪酮代謝物3，使得該物質檢測窗口期延長到45 d左右；又如氧雄龍，它的原形在體內僅能存留5 d左右時間，而氧雄龍代謝物1檢測窗口期延長到15 d，氧雄龍代謝物2檢測窗口期延長至約20 d。

“Sulfate metabolites as alternative markers for the detection of 4-chlorometandienone misuse in doping control”[2]一文中指出，24歲男性一次口服5 mg的氯美雄酮，留取服藥后8 d的尿液；49歲男性，一次口服20 mg的氯美雄酮，同樣留取服藥72 h后的尿液，在兩名志愿者留取的尿液中都發現了多種代謝物。

Georgina Balcells等[3]采用液相色譜串聯質譜檢測，進行了單次口服甲睪酮（10 mg，3位志愿者）或司坦唑醇（6 mg，4位志愿者）的臨床實驗，收集了受試前至受試后31 d的尿樣，分別在22 d和21 d的代謝實驗的尿樣中檢出甲睪酮和司坦唑醇代謝物，說明這種檢測策略的有效性。

Jianghai Lu等[4]的研究表明，采用液相色譜飛行時間質譜法檢測人體尿液中氯司替勃新型代謝物，文中指出，氯司替勃原形在尿液在3 d左右便不能檢測出來，而發現的氯司替勃代謝物s1檢測窗口期延長到停藥后25 d。

A. G. Fragkaki[10]的研究表明，實驗中兩名高加索志愿者男性，分別口服25 mg美替諾龍乙酸酯，留取了用藥后632 h的尿液，并比較了液相色譜高分辨質譜和氣相色譜高分辨質譜檢測靈敏度的區別，第一名志愿者無論采用液相色譜高分辨質譜還是氣相色譜高分辨質譜，都能將檢測窗口延長到12 d左右。第二名志愿者檢測窗口期略短，約10 d左右。說明不同個體在服藥后代謝情況并不完全一致。

Thomas Piper等[11]的研究表明，39歲高加索男性，口服氘代諾龍40 d（溶于20 mL50%乙醇水中），采用氫同位素比質譜和高分辨質譜檢測諾龍長效代謝物，發現了它的新型代謝物。

4 內源性類固醇的檢測

對于內源性類固醇的檢測，目前主要結合使用類固醇生物護照模塊，對運動員尿液中的參數進行長期縱向跟蹤，通過個人的數值建立參考范圍，如果出現異常來判斷陽性[1]。目前生物護照類固醇模塊尚未報告陽性，但是通過生物護照提供的線索，在使用同位素質譜法確證陽性。類固醇生物護照的廣泛運用為檢測內源性蛋白同化雄性激素和一些經修飾過且未囊括在世界反興奮劑禁用清單的新雄性激素提供了堅實保證。

參考文獻

[1] Ioanna Athanasiadou， Sven Voss， Emmanouil Lyris， et al. Analytical progresses of the World Anti-Doping Agency Olympic laboratories： a 2016 update from London to Rio， Bioanalysis， 2016，8（21）：2265.

[2] G Balcells，C Gomez，L Garrostas，et al.Sulfate metabolites as alternative markers for the detection of 4-chlorometandienone misuse in doping control[M].Drug test anal，2016.

[3] Georgina Balcells， Oscar J. Pozo， Argitxu Esquivel， et al， Screening for anabolic steroids in sports： Analytical strategy based on the detection of phase I and phase II intact urinary metabolites by liquid chromatography tandem mass spectrometry[J].Journal of Chromatography A， 2015，1389：65.

[4] Jianghai Lu， María Fernández-？lvarez， Sheng Yang， Genye He， Youxuan Xu， R.Aguilera， New clostebol metabolites in human urine by liquid chromatography time-of-flight tandem mass spectrometry and their application for doping control[J].Journal of Mass Spectrometry， 2015， 50（1）：191.

[5] A. G. Fragkaki， Y. S. Angelis， P. Kiousi， C. G. Georgakopoulos， E. Lyris， Comparison of sulfo-conjugated and gluco-conjugated urinary metabolites for detection of methenolone misuse in doping control by LC-HRMS， GC-MS and GC-HRMS[J].Journal of Mass Spectrometry， 2015，50（5）：740.

[6] Thomas Piper， Wilhelm Schnzer， Mario Thevis.Revisiting the metabolism of 19-nortestosterone using isotope ratio and high resolution/high accuracy mass spectrometry[J].The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology，2016，162：80.