TYK2基因與家兔腸炎的易感性研究

付陸 趙明德 吳小燕 賈先波 賴松家

摘要 [目的] 研究TYK2基因在家兔腸炎發生中的遺傳效應，探討其是否可以作為家兔抗病育種的輔助選擇標記。[方法] 通過構建病例組-對照組腸炎兔群和低纖維誘導的腸炎兔群，PCR產物純化后直接測序，以及qRT-PCR法檢測TYK2基因在回腸和結腸組織中的mRNA表達水平。[結果] 發現TYK2基因外顯子區域有5個cSNP，只有c.1477（c.1477，C>T）位點發生非同義突變，導致氨基酸p.Leu 404 Phe（L>F）的改變，C等位基因增加了腸炎的易感性（OR：1.36；95% CI 1.269～2.151；P=0.019），而等位基因T對腸炎的發生起到了一定的保護作用（OR：0.81，95% CI 0.352～0.960；P=0.018）。TYK2基因不同基因型和不同腸炎程度的mRNA水平均呈現差異表達（P<0.05）。[結論] TYK2（c.1477，C>T）是家兔腸炎易感風險基因，為家兔的抗病育種提供了一個可靠的輔助選擇標記。

關鍵詞 TYK2；腸炎；遺傳易感性

Investigation of Genetic Susceptibility of TYK2 Gene in Rabbit Enteritis

FU Lu1， 2， ZHAO Ming-de1， WU Xiao-yan1， LAI Song-jia2* et al

（1.Laboratory Animal Centre， Southwest Medical University， Luzhou， Sichuan 646000；2.Institute of Animal Genetics， Sichuan Agricultural University，Chengdu， Sichuan 611130）

Abstract [Objective] To study the genetic effects of TYK2 gene in rabbit enteritis and to explore whether it could be used as a Marker-Assisted Selection （MAS） for resistance breeding in rabbits. [Method] To construct case-control rabbit enteritis groups and low fiber induced rabbit enteritis groups， the PCR products were purified and sequenced directly， and the TYK2 gene mRNA levels in ileum and colon tissues were detected by qRT-PCR. [Result] Five cSNPs were detected in exon region of TYK2 gene， and only c.1477 （c.1477， C>T） loci was non synonymous mutation， which caused to the change of amino acid p.Leu 404 Phe （L>F）. The C allele increased the susceptibility of enteritis （OR： 1.36；95% CI 1.269～2.151；P=0.019）， and the T allele was a protective effect on the occurrence of the enteritis （OR： 0.81， 95% CI 0.352～0.960；P=0.018）. The TYK2 mRNA levels in different genotypes and in different degree of enteritis both presented significant difference （P<0.05）. [Conclusion] TYK2 （c.1477， C>T） is a susceptible risk gene of rabbit enteritis， and provides a MAS for the resistance breeding.

Key words TYK2；Enteritis；Genetic susceptibility

家兔為人類提供大量的優質肉、毛和皮等產品，隨著消費的迅速增長，規模化養兔成為發展的必然趨勢。然而，薛家兵等[1]、谷子林[2]報道患黏液性腸病的兔絕大部分死亡，發病率50%～70%，死亡率90%以上，一些兔場發病死亡率甚至高達100%。家兔腹瀉死亡的致病機理十分復雜，防治難度很大，被列入近幾年三大兔病之一（兔瘟、兔腸道疾病和體表真菌病）[3]。因此，研究家兔腹瀉和腸炎的發病機制，從而控制死亡率已經成為當前養兔業中抗病育種的熱點。

TYK2（Tyrosine kinase 2）作為酪氨酸蛋白激酶家族（Janus kinases，JAKs）的一個重要成員，參與機體細胞的增殖、分化、凋亡[4]，介導機體免疫調控[5-6]和腫瘤生成等一系列生命活動過程[7-8]。Minegishi等[5]研究發現TYK2基因純合子突變的病人被臨床診斷為高IgE綜合征，表明其在多種細胞因子的天然免疫和獲得性免疫中扮演重要作用。研究表明TYK2可以通過一種棕色脂肪組織（BAT）的分化來調控小鼠肥胖[9]。既然TYK2基因廣泛參與到上述生理生化反應中，它是否在家兔腸炎發生中也扮演一定的作用，值得探索。

采用病例組-對照組試驗設計擬在480只新西蘭兔中，篩選TYK2基因的編碼區SNP（cSNP），并剖析其中重要cSNP在家兔腸炎發生中的遺傳效應；在低纖維日糧（CF=8.96%）誘導的60只新西蘭腸炎患病兔中，熒光定量PCR法檢測TYK2基因在回腸和結腸組織中的mRNA差異表達水平，為家兔抗病育種提供分子輔助選擇標記。

1 材料與方法

1.1 試驗兔群的構建及樣本采取

選取四川農業大學教學試驗兔場飼養的新西蘭兔為試驗材料，隨機選擇35日齡健康無病、三代內無親緣關系的480只新西蘭兔為試驗動物，構建病例組-對照組腸炎易感性試驗兔群。選取三代內無親緣關系、胎次相近、健康無病、體重相當的35日齡新西蘭斷奶仔兔60只，作為低纖維日糧腸炎試驗兔群，飼喂低纖維飼料（CF=8.96%）。上述2個群體構建的具體方法、分組情況及組織樣品采取參考Zhang等[10]的方法。

1.2 DNA和RNA的提取及檢測

試驗采用DNA提取試劑盒AxyPrepTM Muitisource Genomic DNA Miniprep Kit（Axygen Biosciencs，USA），按照試劑盒說明書要求，從家兔耳組織中提取全基因組DNA。試驗采用Trizol法（Invitrogen），嚴格按照其說明提取回腸和結腸組織總RNA。DNA和RNA的檢測方法相同，先進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，后用核酸蛋白儀進行OD260/OD280值測定。

1.3 PCR擴增及產物測序

根據NCBI提供的家兔TYK2基因參考序列（XM_017338771.1），設計3對引物（表1）進行編碼區的擴增。采用10 μL的反應體系：2×Taq PCR Mix（5 μL）、Forward primer/Reverse primer（各0.3 μL）、Template cDNA（0.8 μL）和ddH2O（3.6 μL）。將上述溶液混合后，按以下條件進行PCR反應：94 ℃變性3 min，94 ℃變性30 s、退火（具體的退火溫度由梯度PCR結果決定）30 s、72 ℃延伸60～90 s，擴增35～38個循環，72 ℃終延伸10 min，4 ℃保存。將PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，膠回收純化后得到的PCR產物送至北京六合華大基因測序中心測序。

1.4 實時熒光定量PCR

先使用反轉錄試劑盒PrimeScriptTM RT Reagent Kit with gDNA Eraser（Cat.# RR047Q，TaKaRa），進行cDNA的合成，具體操作按試劑盒的說明書進行。然后采用2-△△CT法，以HPRT和GAPDH基因作為雙內參，在CFX96TM Real-time System上檢測TYK2基因在回腸和結腸組織中的mRNA表達水平。根據TYK2基因參考序列，設計熒光定量引物（表1），由北京六合華大基因有限公司合成。按照SYBR Premix Ex TaqTM II（TaKaRa，Dalian）試劑盒的使用說明書加樣，使用標準品作為板間對照，并設NTC，每個待測樣3個重復。

1.5 數據處理

基因分型的個體數直接以n表示，mRNA相對表達量表示為平均值±標準誤。使用SAS 9.2軟件分析TYK2基因與腸炎的遺傳效應。運用SPSS 19.0分析處理，組間的差異比較采用單因素方差分析。P<0.05表示其差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 低纖維日糧誘導家兔腸炎炎癥程度的分類

在60只低纖維日糧誘導家兔腸炎中（試驗期間死亡和試驗結束后屠宰），臨床癥狀評分（CSS）為2和3分的有40只，其中35只的剖檢癥狀分析評分（GLS）同樣較高，主要表現為食欲下降、腹部脹氣、盲腸內容物結塊，大部分個體回腸內有膠凍狀物質（22/35），部分個體結腸伴隨著回腸出現膠凍狀物質（17/35）。觀察組織病理切片發現各腸斷在發生嚴重腸炎時，都存在組織損傷和炎性損傷，并且回腸和結腸段病變得更為嚴重（圖1）。患病家兔的回腸和結腸段，腸腔中未見紅細胞和淋巴細胞內容物；腸絨毛多處毛細血管充血；部分腸上皮細胞壞死、溶解，可見少量中性粒細胞浸潤（圖1b和d中①標注）；腸絨毛中腸腺細胞發生壞死性溶解，可見嗜堿性粒細胞浸潤（圖1b和d中②標注）；黏膜固有層、黏膜下層結締組織間的間質有炎性細胞浸潤（圖1d中③標注）。最終，將低纖維誘導試驗兔群分為健康組（12只）、輕微腸炎組（13只）和嚴重腸炎組（35只）。

2.2 TYK2基因編碼區擴增和直接測序結果

對新西蘭兔TYK2基因的外顯子區域，分別設計引物進行PCR擴增，擴增產物特異性好，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，電泳條帶單一，明亮致密，大小與目的條帶一致。將目的基因PCR擴增產物膠回收后，送至北京六合華大基因公司進行直接測序，共發現5個cSNP，分別為c.1095（exon7，G>A），c.1477（exon9，C>T），c.2013（exon13，C>T），c.2133（exon14，T>C），c.2166（exon14，C>T），其中c.1477位點發生非同義突變，導致氨基酸p.Leu 404 Phe（L>F）的改變，其余的cSNP均為同義突變。

2.3 c.1477與家兔腸炎易感性分析

試驗共選取了480只新西蘭兔（病例組253，對照組227），對c.1477位點采用直接測序的方法進行基因分型，結果發現純合CC型、TT型、雜合CT型在病例組和對照組中個體數分別為156/118，20/58，77/51。

群體遺傳結構分析發現在病例組和對照組中，C等位基因均處于優勢地位，其頻率分別為76.88%和63.22%（P<0.05），而T等位基因分別為23.12%和36.78%（P<0.05）。2群體中基因型頻率CC（61.66% vs.51.98%），TT（7.91% vs.25.55%），CT（30.43% vs.22.47%）差異均顯著（P<0.05）。通過SAS 9.2軟件計算等位基因C增加了腸炎的易感性（OR：1.36；95% CI 1.269～2.151；P=0.019），而等位基因T對腸炎的發生起到了一定的保護作用（OR：0.81，95% CI 0.352～0.960；P=0.018）。HWE評估檢驗發現病例組和對照組都遵循HWE平衡定律（P>0.05）。使用SNPStasts軟件評估5種遺傳模型對該突變的可靠性。根據AIC和BIC值的大小，確定隱性模型為這個位點的最適模型。利用這個模型，關聯性分析表明C/C基因型增加了腸炎的易感性（OR：1.73；95% CI 1.870～2.800；P<0.001）（表2）。

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