單核細胞增生李斯特氏菌生物膜形成特性

陳康勇 彭芳 薛竣仁 鐘為銘 高志鵬

摘要 [目的]研究單增李斯特氏菌生物膜的形成特性。[方法]采用24孔板法培養生物膜，分別采用結晶紫染色法和光學顯微鏡進行生物膜的定量和定性研究，觀察在不同培養時間（8、16、24、32、40、48 h）單增李斯特氏菌生物膜的形成狀況。[結果]隨著培養時間的增加，單增李斯特氏菌生物膜生物量逐漸增加，生物膜經歷了黏附、微菌落形成、大菌落形成到成熟的全部過程。[結論]試驗結果為單增李斯特氏菌生物膜相關研究提供了理論依據。

關鍵詞 單核細胞增生李斯特氏菌；生物膜；形成特性

Biofilm Formation Characteristics of Listeria monocytogenes

CHEN Kang-yong1，PENG Fang1，XUE Jun-ren1，GAO Zhi-peng1，2* et al （1.College of Animal Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128； 2.Collaborative Innovation Center for Efficient and Health Production of Fisheries in Hunan Province，Changde，Hunan 415000）

Abstract [Objective]The aim was to investigate the biofilm formation characteristics of Listeria monocytogenes. [Method]To investigate the characteristics of Listeria monocytogenes biofilm at different incubation times （8，16，24，32，40，48 h），24-well plate method was used to cultivate biofilm，and quantitative and qualitative data were obtained by crystal violet staining assay and light microscopy.[Result]With the increase of culture time，the biomass of Listeria monocytogenes biofilm increased gradually，and the biofilm went through the process of adhesion，microcolony formation，macrocolony formation to mature.[Conclusion]The results provide a theoretical basis for the related research of Listeria monocytogenes biofilm.

Key words Listeria monocytogenes；Biofilm；Formation characteristics

生物膜（BF）是細菌為了適應生存環境，黏附于非生物或者活性組織的表面，包被于自身分泌的胞外基質中，形成的一種三維聚合網狀結構，細菌生物膜是一種和浮游生長對應的生長方式[1-3]。生物膜參與65%以上的感染，尤其是與醫療器械相關的、機體表面的（如皮膚、軟組織等）和慢性感染，原因主要是生物膜對宿主防御和抗菌藥物具有很強的抵御能力[4-6]。生物膜是細菌耐藥性產生的重要原因，可使細菌的耐藥性提高10～1 000倍[7-8]。生物膜感染已成為全球關注的問題。

單核細胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是一種能在冷藏的溫度下進行繁殖的致病菌，由于該細胞的苯酚-水浸出物能夠誘導單核細胞生成，所以被命名為“單核增生細菌”[9]。人或者牲畜感染之后主要表現出敗血癥、胃腸炎、腦膜炎、孕婦流產等癥狀[10]。嬰幼兒、老年人以及免耐受病人的臨床死亡率約為30%[11]。該菌種在自然界廣泛存在，對于不利的生長環境條件具有很強的耐受能力，在4 ℃冰箱中可生長繁殖，所以各類冷凍食品均成為被感染對象，如肉制品、奶制品、冰激凌等[12]。在對含有單增李斯特氏菌的乳制品進行超高壓處理研究中發現，在500 MPa、10 min、20 ℃下處理乳制品，雖然能夠降低其單增李斯特氏菌活菌量，但仍有細菌存活并繁殖[13]。同時，單增李斯特氏菌對水產品也具有較高的污染程度[14-15]。單增李斯特氏菌所產生的生物膜可保護其不受抗菌藥物作用，并且能降低機體免疫細胞的吞噬作用。試驗表明，在任何溫度條件下，單增李斯特氏菌可在固體表面形成生物膜，并且能夠在很長時間黏附于固體表面，其生物膜的形成引起了食品、用品衛生安全的隱患[16]。

單增李斯特氏菌生物膜所導致的相關性疾病患病率逐年上升，至今很少有藥物能有效控制該類感染，深入研究單增李斯特氏菌生物膜形成特性，對于尋找有效的防治藥物和方法具有重要意義。筆者研究了單增李斯特氏菌生物膜的形成過程，以期為單增李斯特氏菌研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌。單核細胞增生李斯特氏菌（編號：ATCC19115），購自廣東省微生物研究所。

1.1.2 主要試劑。LB肉湯（廣東環凱微生物科技有限公司）、技術瓊脂粉（廣東環凱微生物科技有限公司）、0.1%結晶紫溶液（Sigma公司）、95%乙醇溶液、磷酸鹽緩沖液（PBS）和4%多聚甲醛（Sigma公司）。

1.1.3 主要儀器。

熒光多功能酶標儀、光學顯微鏡、24孔和96孔細胞培養板、高壓滅菌鍋和高速彩色平臺掃描儀。

1.2 方法

1.2.1 單增李斯特氏菌生物膜培養。

采用24孔板法，具體操作：取單個單增李斯特氏菌菌落接種到5 mL LB液體培養基中，37 ℃靜置培養24 h。取10 μL 菌液轉接至預先加入無菌蓋玻片（12 mm）和2 mL 新鮮LB培養液的24孔細胞培養板中，然后37 ℃靜置培養。

1.2.2 不同培養時間對單增李斯特氏菌生物膜形成特性的影響。

按培養時間分別設置8、16、24、32、40、48 h 6個試驗組，每組分別做6個平行，按照“1.2.1”進行生物膜培養，在上述時間點進行結晶紫染色試驗和顯微鏡觀察。

1.2.3 單增李斯特氏菌生物膜結晶紫染色試驗。

利用生物膜內物質可與特殊染料結合的原理，通過染色的方法對生物膜進行定性或定量分析。單增李斯特氏菌生物膜形成后，將24孔板從培養箱中取出，吸出培養液，用無菌PBS浸洗蓋玻片3次，然后用4%多聚甲醛固定20 min，棄固定液，并用無菌PBS浸洗3次，洗去浮游菌，使黏附在蓋玻片的生物膜自然風干，室溫下用0.1%結晶紫染色20 min，吸除染色液后，用無菌PBS浸洗3次，自然風干，然后用高速彩色平臺掃描儀掃描拍照。

1.2.4 單增李斯特氏菌生物膜生物量的測定。

單增李斯特氏菌生物膜形成后，吸出培養液，用無菌PBS浸洗蓋玻片3次，每孔加入200 μL 95%乙醇，置于搖床30 min使結晶紫完全溶解，溶解液轉移至96孔細胞培養板中，并用酶標儀測定540 nm波長處的吸光度，即OD540，每個試驗重復3次。

1.2.5 顯微鏡觀察單增李斯特氏菌生物膜。

方法同“1.2.3”，結晶紫染色后，用無菌PBS浸洗蓋玻片3次，然后置于100倍油鏡下觀察生物膜的形成狀況，并拍照記錄。

2 結果與分析

2.1 不同培養時間下單增李斯特氏菌生物膜結晶紫染色結果

研究發現單增李斯特氏菌生物膜的形成分為4個階段，即黏附階段、微菌落形成階段、大菌落形成階段和成熟階段。①黏附階段（0～16 h）：細菌逐漸聚集并黏附于介質（蓋玻片）表面，生物膜形成速度較慢；②微菌落形成階段（17～24 h）：生物膜結晶紫染色較淺，微菌落開始形成，并呈斑塊狀分布；③大菌落形成階段（25～32 h）：細菌聚集明顯，生物膜斑塊變大，32 h時布滿蓋玻片，結晶紫染色加深；④成熟階段（33～48 h）：結晶紫染色比前32 h明顯加深，生物膜斑塊更加密集，厚度增大，40 h時生物膜基本形成，33～48 h形成的生物膜的OD540快速增長。隨著培養時間的增加，單增李斯特氏菌的生物膜呈現出從黏附聚集到成熟的過程，于48 h達到最成熟的狀態（圖1、2）。

2.2 不同培養時間下單增李斯特氏菌生物膜顯微觀察結果

①黏附階段：在物鏡為100倍的顯微鏡下可觀察到生物膜的厚度小，菌落間的通道多，說明生物膜形成并不成熟。②微菌落形成階段：微菌落開始形成，生物膜斑塊數量增多，生物膜的厚度開始增加，菌落間通道變少。③大菌落形成階段：結晶紫染色變深，開始形成較為致密的生物膜，但生物膜斑塊比較分散，菌落間通道繼續變少。④成熟階段：生物膜斑塊大量增加并且形成了牢固、穩定的網狀三維結構，生物膜厚度明顯增加，染色顯著加深，培養至48 h時生物膜極厚，菌落之間幾乎沒有通道，生物膜完全成熟（圖3）。可見，生物膜形成期間，菌落間的通道不斷減少，生物膜斑塊逐漸增加并且密集，生物膜的厚度逐漸增加，并趨于成熟。

3 討論

細菌生物膜的形成是一個動態過程，隨著細菌的生長，生物膜對營養因子的通透性變差，同時細菌也開始老化甚至失去了成膜能力。進入成熟期后，隨著生存環境中營養等限制因子的消耗以及代謝產物的積累，細菌的生長開始受到限制，生物膜的形成達到一個相對穩定的狀態，此時生物膜的厚度基本穩定。進入衰老期后，伴隨著營養物質的不斷消耗，生物膜中細菌的大部分蛋白質和RNA的合成速率降低，致使胞外多糖的合成量減少，生物膜的結構出現崩解甚至細菌也開始從生物膜表面脫落，再次成為游離菌，使生物膜的厚度減少。

單增李斯特氏菌生物膜的形成是一個復雜的過程，涉及到多種蛋白、核酸分子和多糖等因素，同時也受到各種調控網絡的共同作用。深入研究單增李斯特氏菌生物膜的形成和調控的分子機制對尋找特異性干預靶點具有重要意義。該試驗目前只是研究培養時間對單增李斯特氏菌生物膜形成的影響，主要是通過觀察細菌生物膜的形成情況來說明培養時間對生物膜的影響，后續試驗還可研究環境因素對單增李斯特氏菌生物膜基質組成的影響，通過觀察環境因素對生物膜中蛋白質、胞外多糖、胞外DNA組成的影響，進一步探究單增李斯特氏菌生物膜的形成機制。

4 結論

采用24孔板法和結晶紫染色法研究單增李斯特氏菌生物膜的形成過程，發現在靜置培養條件下的單增李斯特氏菌生物膜的形成經歷了4個階段，0～16 h為細菌黏附階段，17～24 h為微菌落形成階段，25～32 h為大菌落形成階段，33～48 h為成熟階段。細菌黏附階段，菌落間的通道多，形成生物膜速度慢。微菌落形成階段，隨著培養時間的延長，生物膜結晶紫染色顏色變深，細菌開始形成微菌落，但形成速度較慢，并開始形成生物膜斑塊。大菌落形成階段，細菌形成的大量微菌落聚集成大菌落，生物膜斑塊增大，開始形成較為致密的生物膜，結晶紫染色快速變深。成熟階段，生物膜斑塊快速增大并且密集，形成了具有牢固、穩定的網狀三維結構的生物膜，菌落間的通道不斷減少。培養48 h期間，單增李斯特氏菌生物膜的生物量隨培養時間的增加而增大，表明細菌生物膜的生長經歷了從黏附聚集到成熟的過程，在48 h生物膜生長達到完全成熟的狀態。

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