HPLC法測定阿維拉霉素預(yù)混劑中阿維拉霉素的含量

潘鎮(zhèn)濤　林凌　鄭雪媚

摘 要：目的：采用HPLC法測定10%阿維拉霉素預(yù)混劑中阿維拉霉素的含量。方法：測定色譜條件為：流動相：乙腈-0.2%（g/mL）磷酸二氫銨溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0）（51∶49）；色譜柱：菲羅門C18（5μm，4.6mm×250mm）；檢測波長：214nm。結(jié)論：阿維拉霉素在0.1～5mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2為0.9998；阿維拉霉素的回收率為98.7%～101.0%；阿維拉霉素的測定重復(fù)性RSD為0.97。結(jié)論：該方法具有分析時(shí)間短、線性范圍寬、定性結(jié)果精確和重現(xiàn)性好、樣品前處理簡便等特點(diǎn)，為阿維拉霉素預(yù)混劑的質(zhì)量控制提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞：10%阿維拉霉素預(yù)混劑；HPLC；含量測定

中圖分類號 S948 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2017）12-0157-003

Abstract：Objective：High performance liquid chromatographic method was used for the determination of the content of Avilamycin in 10% Avilamycin Premixt. Method：Determination of chromatographic conditions：mobile phase：acetonitrile：0.2%（g/ml）ammonium dihydrogen phosphate solution（51：49 v/v）with pH value at 3.0（adjusted by phosphate），column as C18（5μm，4.6mm×250mm），detection wavelength of 214nm.Conclution：0.1～5mg/mL Avilamycin has good linearity，the correlation coefficient R2 is 0.9998；the recovery rate of avilamycin is 98.7%～101.0%；the detection repeatability RSD of avilamycin is 0.97. Conclution：With features of short testing time，wide linearity，precise assay result，good repeatability，easy pre-treatment of samples and so on，such HPLC assay method provides good basis for avilamycin premix quality control.

Key words：10% avilamycin premix；HPLC；Determination of content

阿維拉霉素預(yù)混劑（Avilamycin）是作為飼料添加劑中的一種抗生素，屬于混合型的低聚糖[1]。阿維拉霉素預(yù)混劑是由阿維拉霉素與大豆粉和防塵油配制而成，阿維拉霉素又稱為卑霉素、阿美拉霉素、阿維霉素、肥拉霉素，是一種新型消化促進(jìn)劑和代謝調(diào)節(jié)劑[2]，是由產(chǎn)綠色鏈霉素菌Streptomyces viridoehrongenes發(fā)酵而生成的二氯異扁枝衣酸酯，屬于正糖霉素族的寡糖類抗生素[3]。阿維拉霉素預(yù)混劑對革蘭氏陽性菌、產(chǎn)氣梭狀芽孢桿菌、金黃色葡萄桿菌、鏈球菌（乳酸菌除外）以及部份革蘭氏陰性菌十分敏感，可以有效防治仔豬腹瀉，具有促生長作用，是一種新型的促生長素類飼料添加劑。

阿維拉霉素預(yù)混劑因阿維拉霉素結(jié)構(gòu)獨(dú)特，具有安全性高、不易被腸道吸收、基本無殘留、毒性小、不存在交叉耐藥性、易分解等特點(diǎn)，因?qū)嶋H效果穩(wěn)定而獲得了較高的評價(jià)。由于阿維霉素?zé)o藥殘現(xiàn)象，其在畜禽飼料中添加使用時(shí)，無需停藥期。目前，世界上主要的養(yǎng)殖業(yè)國家或地區(qū)如歐盟、日本、巴西，效美素被廣泛地添加于雞、豬飼料中，以提高畜禽的生產(chǎn)績效和抗病能力。我國農(nóng)業(yè)部于2005年批準(zhǔn)進(jìn)口使用進(jìn)口獸藥再注冊目錄，批準(zhǔn)號為（2005）外獸藥證字56號。

目前，國內(nèi)外報(bào)道的阿維拉霉素的檢測方法有微生物效價(jià)測定方法、氣相色譜法-質(zhì)譜聯(lián)用檢測法（GC-MS）、高效液相色譜法（HPLC）、放射性同位素標(biāo)記法和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測法（HPLC-MS），但我國目前尚未建立阿維拉霉素預(yù)混劑的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法[4]。因此，為了加強(qiáng)對阿維拉霉素預(yù)混劑的監(jiān)控，建立和規(guī)范其檢測方法，并制定相應(yīng)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)已迫在眉睫，本文按照中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第2060號要求，根據(jù)阿維拉霉素的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，建立了測定阿維拉霉素預(yù)混劑中阿維拉霉素含量的HPLC法，為阿維拉霉素預(yù)混劑的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備與化學(xué)試劑 日本島津SPD-20A反相液相色譜儀；柱溫箱CTO-20AC；1/100000天平METTLER MS105DU；超純水儀UPR-5T；超聲波清洗器KQ-500DE；10%阿維拉霉素預(yù)混劑來源：效美素，美國禮來公司英國DISTA生產(chǎn)廠；阿維拉霉素對照品來源：禮來公司，含量A為86.93%，B為11.00%；水為超純水；乙腈為色譜純。

1.2 色譜條件 流動相：乙腈-0.2%（g/ml）磷酸二氫銨溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0）（51∶49）；色譜柱：菲羅門C18（5μm，4.6mm×250mm）；檢測波長：214nm；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20μL。

1.3 對照品溶液的配制 （1）精密稱取在60℃真空干燥3h的對照品40mg（實(shí)際稱樣量40.45mg，對照品含量97.93%），至100mL容量瓶中，加水2mL，靜置5min使對照品濕潤，加丙酮20mL，超聲15min，冷卻后，用乙腈-0.132%（g/ml）磷酸氫二銨溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH值至7.0）（50∶50）稀釋至刻度，制成約0.4mg/mL的對照品溶液。

1.4 樣品溶液的配制 精密稱取500mg試樣到50mL容量瓶中，加水2mL，靜置5min使對照品濕潤，加丙酮20mL，超聲15min，冷卻后，用丙酮稀釋至刻度，過濾，精密量取10mL至25mL容量瓶中，乙腈-0.132%（g/mL）磷酸氫二銨溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH值至7.0）（50∶50）定容，制成約0.4mg/mL的樣品溶液。

1.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取上述1mg/mL的對照品20μL分別按1.2色譜條件下進(jìn)樣，測定并計(jì)算柱效、分離度和拖尾因子（見表1）。

1.6 線性試驗(yàn) 取上述對照品儲備液分別稀釋成5mg/mL、2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL、0.2mg/mL、0.1mg/mL的系列對照品溶液，按1.2色譜條件測定，以峰面積A對濃度進(jìn)行回歸，阿維拉霉素峰面積A的回歸方程分別為：Y=107x+98580（R2 =0.9998），說明阿維拉霉素在0.1～5mg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系（圖1）。

1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取同一批供試品溶液，按1.2項(xiàng)色譜條件測定，進(jìn)樣5次，得阿維拉霉素含量的RSD為0.97，表明樣品重復(fù)性良好（表2）。

1.8 回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的同一批樣品（含量為98.010mg/g）約500mg（共9份）置于100mL容量瓶中，分別加入對照品30mg、50mg和70mg，按上述1.4項(xiàng)要求處理，進(jìn)樣測定。樣品阿維拉霉素的回收率為99.43%（表3）。

1.9 檢測限 在上述色譜條件下，測定最低檢測限為2ng。

1.10 供試品測定 取3批樣品及標(biāo)準(zhǔn)溶液，按外標(biāo)法測定，每批樣品進(jìn)樣2次，計(jì)算樣品樣品中阿維拉霉素含量（圖2）。3批樣品的含量測定結(jié)果分別為97.47μg/mL、98.01μg/mL、97.68μg/mL。

2 結(jié)論

本試驗(yàn)建立了HPLC法測定10%阿維拉霉素預(yù)混劑中阿維拉霉素含量的方法，測定色譜條件為：流動相為乙腈-0.2%（g/ml）磷酸二氫銨溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0）（51∶49），色譜柱為菲羅門C18（5μm，4.6mm×250mm），檢測波長為214nm，流速為1.0mL/min，在0.1～5mg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。該方法具備分析時(shí)間短、線性范圍寬、定性結(jié)果精確和重現(xiàn)性好、樣品前處理簡便等特點(diǎn)，為阿維拉霉素預(yù)混劑的質(zhì)量控制提供了依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]Irina Treede，Lene Jakobsen，F(xiàn)inn Kirpekar，et al.The avermectins resistance determinants AviRa and AviRb methylate 23S rRNA at the guanosine 2535 base and ridine 2479 ribose[J].Molecular Microbioligy，2003，49（2）：309-318.

[2]陳永輝，劉波，曾兆國，等.阿維拉霉素研究進(jìn)展[J].飼料工業(yè)，2007，28（14）：9-11.

[3]任健，童應(yīng)凱，吳兆亮.卑霉素的合成途徑及分子生物學(xué)進(jìn)展[J].天津農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，15（3）：47-51.

[4]魏德寶，鮑恩東.飼料中阿維拉霉素含量反相HPLC檢測方法的建立[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，33（3）：99-103.

（責(zé)編：張宏民）