洛伐他汀高產菌株的選育

摘 要：為了提高紅曲霉發酵生產洛伐他汀的能力，分別采用紫外線、亞硝酸、硫酸二乙酯對出發菌株（Monascus sp.）進行誘變處理。結果表明：3種誘變劑對Monascus sp.的誘變效果有較大差異，其中紫外線誘變效果最好，硫酸二乙酯次之，亞硝酸最差。通過篩選，得到2株高產突變株，分別命名為：Monascus sp.UV-5、Monascus sp.DE-8，其產量分別為 0.239 mg/mL、0.223 mg/mL，比原始菌株分別提高了42.3%、32.7 %。遺傳穩定試驗結果顯示，Monascus sp.UV-5、Monascus sp.DE-8遺傳性能較穩定，可應用于生產。

關鍵詞：洛伐他汀；紅曲霉；誘變；紫外線；硫酸二乙酯；亞硝酸

中圖分類號 S511 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2017）12-0027-03

Abatract：In order to improve lovstatin yield of Monascus sp.，the starting strains were treated by treated by UV，HNO2 and DES respectively. The results showed that three kinds of Mutagens had different effects on Monascus sp.，UV had best mutagenesis effects，then was DES and HNO2 was the worst. Two high and stable yield mutants were obtained and named Monascus sp. UV-5 and Monascus sp.DE-8 respectively.The lovstatin yield of Monascus sp.UV-5，Monascus sp. DE-8 was 0.239mg/mL and 0.223 mg/mL，which increased 42.3% and 32.7% compared with the original strain.The consecutive culture of Monascus sp. UV-5，Monascus sp. DE-8 showed that genetic performance was stable and can be used in production.

Key words：Lovstatin；Monascus sp.；Mutagenesis；UV；DES；Nitrous acid

近年來，隨著經濟的高速發展，人民生活水平不斷提高。我國民眾的飲食結構發生了很大的改變，過多地攝入高熱量、高脂質的食物，導致高血脂、高血壓、冠心病等“富貴病”發病率顯著增加。目前，臨床上治療該類疾病的主要是他汀類藥物，最重要的是洛伐他汀。洛伐他汀（Lovastatin）是一類在臨床上應用廣泛的降血脂、降膽固醇藥物，作為體內羥甲戊二酰輔酶A（HMG-CoA）的結構類似物，能競爭性抑制HMG-CoA的代謝，減少機體內膽固醇的生成，從而對高血壓和冠心病等疾病起到積極的防治作用[1-4]。當前，洛伐他汀主要是通過微生物發酵生產，在微生物發酵中，優良的菌種是獲得生產成功的關鍵[5]。誘變育種是獲得高產菌株的簡便有效的手段在微生物育種中被廣泛應用。課題組采用多種誘變劑對洛伐他汀產生菌株紅曲霉進行處理，以期獲得穩定高產菌株，為進一步開發功能性紅曲提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株 紅曲霉（Monascus sp.），粗糙脈胞菌（Neurospora crassa），均購于中科院微生物所，保藏于本院院生物制藥國家級實訓基地。

1.1.2 培養基 斜面培養基及平板培養基：馬鈴薯蔗糖固體（PDA）培養基；發酵培養基：馬鈴薯蔗糖液體（PD）培養基。

1.1.3 洛伐他汀標準品 純度≥98%，購于上海永葉生物科技有限公司。

1.1.4 主要儀器設備 HJ-1磁力攪拌器（江蘇醫療）；CBV-1500A超凈工作臺（上海瑞仰）；QYC.2102搖床（上海福瑪）；HPS-250生化培養箱（哈爾濱東明）；高效液相色譜儀（美國戴安）。

1.2 實驗方法

1.2.1 紫外線（UV）誘變 在超凈工作臺上，用接種環取紅曲霉孢子2環，用無菌水制成孢子懸液，將孢子懸液分成6份（各5mL），放在紫外誘變裝置中分別處理0s、30s、60s、90s、120s、150s。然后取誘變處理后的孢子懸液0.1mL分別涂布于6個固體平板上，倒置培養3d，計算致死率[6]。再分別取0.5mL誘變后的孢子液進行管碟法試驗，以抑菌圈直徑為指標，初篩突變株。突變效果好的進行搖瓶發酵試驗，以洛伐他汀產量為指標進行復篩，并評價誘變效果。

1.2.2 亞硝酸（HNO2）誘變 孢子懸液制備方法同1.2.1，將孢子懸液分成6份（各5mL），分別加入0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25mol/L NaNO2溶液1mL，然后加入1mL pH4.4醋酸緩沖液，于32℃保溫處理20min，加入pH8.6的Na2HPO4溶液，調整pH為7，終止誘變作用。適當稀釋后涂布于固體進行實驗，計算致死率[6]。再分別取0.5mL誘變后的孢子液進行管碟法試驗，以抑菌圈直徑為指標，初篩突變株。突變效果好的進行搖瓶發酵試驗，以洛伐他汀產量為指標進行復篩，并評價誘變效果。

1.2.3 硫酸二乙酯（DES）誘變 孢子懸液制備方法同1.2.1，將孢子懸液分成6份（各5mL），分別加入0%、1%、2%、3%、4%、5%（v/v）的DES溶液5mL誘變處理10min，立刻加10mL的25%硫代硫酸鈉溶液中止反應。誘變后的孢子懸液經過適當的稀釋后，取出0.1mL孢子液涂布到分別固體平板培養基上進行實驗，并計算致死率。并進行管碟法初篩和搖瓶發酵復篩，并評價誘變效果。

1.2.4 菌種篩選 采用管碟法[7]進行初篩。利用粗糙脈胞菌對洛伐他汀敏感的原理，在粗糙脈孢菌孢子液的固體培養基上進行抑菌實驗，通過測量抑菌圈直徑D進行初篩。

采用HPLC法進行復篩。高效液相測定洛伐他汀的條件為[8]：色譜柱：XDB C18柱；檢測波長237nm，流動相：甲醇：水（體積比為70：30），柱溫26℃，體積流量1.0mL/min，進樣量20μL。

1.2.5 突變株遺傳穩定性研究 將篩選到的實變株進行斜面傳代實驗，連續傳種5代，分別測定洛伐他汀的產量，考察菌株的遺傳穩定性能。

2 結果與分析

2.1 三種誘變劑致線曲線與分析

由圖1、圖3可知，紅曲霉菌株對UV、DES均比較敏感，致死率與誘變劑劑量呈正相關。當UV照射時間為120s 時，致死率為72.1%。DES濃度為4%時，致死率為74.6%。由圖2可知，在實驗劑量范圍內，紅曲霉對HNO2不敏感，致死率低且變化不明顯，因此，不宜選HNO2作為紅曲霉的誘變劑。

2.2 UV誘變結果 從篩選平板上挑取抑菌圈直徑D≥1.48cm的10株菌株孢子，置于溫度為32℃、轉速為160 r/min搖床上發酵7d，測洛伐他汀產量。所得結果見表1。

由表1可知，在所得到的10株突變株中，抑菌圈直徑比原始菌株均有不同程度的增加，但洛伐他汀的產量則有高有低，總的來看大部分菌株的產量是提高的，即發生了正向突變，如UV-5、UV-10；而有少部分菌株的產量不升反降，如：UV-6、UV-9。其中UV-5的產量最高，達到了0.239mg/mL，相對于出發菌株提高了42.3%。說明出發菌株（Monascus sp.）對紫外線敏感，采用紫外線單因素處理即可得到較理想的誘變效果。

2.3 HNO2誘變結果 經亞硝酸誘變后，通過初篩選擇9株抑菌圈直徑D≥1.42cm的突變株，置于溫度為32℃、轉速為160 r/min搖床上發酵7d，測洛伐他汀產量。所得結果見表2。由表2可知，經亞硝酸誘變后，紅曲霉對粗糙脈胞菌抑菌圈直徑及洛伐他汀產量變化幅度均較小。在所得的9株紅曲霉突變株中，抑菌圈變化范圍1.42～1.76cm之間，洛伐他汀產量最高是HN-4、HN-8菌株，均為0.184mg/mL，比出發菌株的產量提高不到10%，說明該紅曲霉對亞硝酸不大敏感，這與致線曲線分析是一致的。

2.4 DES誘變結果 經硫酸二乙酯誘變后，通過初篩選擇10株抑菌圈直徑D≥1.52cm的突變株，置于溫度為32℃、轉速為160r/min搖床上發酵7d，測洛伐他汀產量。得到結果見表3。

表3結果表明，篩選所得到的10株突變株中，大部分菌株發生了正向突變，產量均有不同程度提高，其中洛伐他汀產量最高的菌株為DE-8，達到了0.223mg/mL，增幅為32.7%。說明該紅曲霉對DES較為敏感，應用DES對其進行誘變育種能得到較理想的效果。但從洛伐他汀產量的提高幅度來看，DES的誘變效果不如UV好。可能的原因是此兩種誘變劑的誘變機理不相同所造成的，UV能誘發DNA形成胸腺嘧啶二聚體，導致復制中發生錯配而引起突變；而DES能與DNA中堿基發生化學反應，使堿基結構發生變化，導致堿基配對的轉換或顛換，從而引起突變[9]。

2.5 UV-5、DE-8遺傳穩定性研究 對UV-5、DE-8菌株進行遺傳穩定性能測定，在斜面培養基上進行5次傳代實驗，以洛伐他汀產量為測試指標，所得結果如表4所示。從表4可以看出，該2菌株洛伐他汀產量均較穩定，相對產量≥95%。表明它們的遺傳性能均穩定，有一定的生產應用價值。

3 結論

采用UV、DES、HNO2 3種誘變劑分別對紅曲霉進行誘變，采用管碟法初篩結合HPLC法復篩的方法選育高產菌株。實驗結果表明：3種誘變劑對Monascus sp.的誘變效果有較大差異，其中紫外線誘變效果最好，硫酸二乙酯次之，亞硝酸最差。通過篩選得到2株高產突變株，分別命名為：Monascus sp.UV-5、Monascus sp.DE-8，產量分別為 0.239mg/mL、0.223mg/mL，比原始菌株分別提高了42.3%、 32.7 %。遺傳穩定試驗顯示，Monascus sp.UV-5、Monascus sp.DE-8遺傳性能較穩定，可應用于生產。因此誘變育種是微生物育種中一種簡便、有效的方法。但UV與DES對紅曲霉誘變是否有協同作用，需進一步進行研究。

參考文獻

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[9]周德慶.微生物學教程[M].北京：高等教育出版社，2002：212-217. （責編：徐煥斗）