辣椒素對變應性鼻炎大鼠鼻黏膜及P物質表達的影響研究

王武臣　閆小會　馬瑞霞

[摘要] 目的 探討辣椒素對變應性鼻炎大鼠鼻黏膜形態、P物質表達的影響及作用機制。 方法 建立變應性鼻炎動物模型，采用辣椒素滴鼻，記錄大鼠噴嚏次數、抓鼻次數、流涕情況評分疊加計分。對比正常組、未治療組、治療組鼻黏膜形態，對比治療后鼻黏膜肥大細胞、P物質含量變化。 結果 治療后治療組變應性鼻炎癥狀明顯緩解（P<0.05），治療組肥大細胞、P物質含量較未治療組明顯減少（P<0.05）。 結論 辣椒素對變應性鼻炎有治療作用，其作用機制與減少P物質含量、降低IgE介導的I型變態反應相關。

[關鍵詞] 辣椒素；P物質；變應性鼻炎

[中圖分類號] R765.21 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）16-0033-03

[Abstract] Objective To investigate the effect of capsaicin on nasal mucosal morphology and substance P expression in allergic rhinitis rats and its mechanism. Methods Animal model of allergic rhinitis was established. Capsaicin was used intranasally， and the number of sneezes and catching nose， runny nose situation were recorded and scored， and the scores were superimposed. The nasal mucosal morphology among normal group， untreated group and treated group was compared. The changes of nasal mucosa mast cells and substance P content after treatment were compared. Results The symptoms of allergic rhinitis in the treatment group after treatment were significantly relieved（P<0.05）. The nasal mucosa mast cells and the content of substance P in the treatment group were significantly lower than those in the untreated group（P<0.05）. Conclusion Capsaicin has a therapeutic effect on allergic rhinitis， and its mechanism is related to reduce the content of substance P and reducing IgE-mediated type Ⅰ allergic reaction.

[Key words] Capsaicin； Substance P； Allergic rhinitis

近年來研究發現，變應性鼻炎（allergic rhinitis，AR）的發生與神經肽如P物質（SP）、降鈣素基因相關肽（CGRP）關系密切[1]。這些神經肽與血流量和鼻黏膜腺體的分泌有關，并參與免疫應答的調節[2]。SP可以增強神經興奮性，若SP大量釋放，可引起鼻分泌的亢進[3-4]。辣椒素（capsaicin，CAP）可以選擇性消耗神經末梢釋放出的神經肽類物質，因此又被稱為P物質耗竭劑[5-6]，可以使感覺神經敏感性下降。本研究通過建立AR動物模型觀察辣椒素對AR大鼠癥狀、鼻黏膜形態、P物質表達的影響，從而探討辣椒素在變應性鼻炎防治中的作用機制。

1 材料與方法

1.1動物及分組

健康雄性SD大鼠[6]30只[動物批號：SCXK（京），2016-0002]，體重180～220 g；飼養條件：寧夏醫科大學動物實驗中心，無特殊病原體（SPF）；飼養濕度：40%，飼養溫度：（22±2）℃。隨機分為三組，每組10只，分別為正常對照組（正常組）、變應性鼻炎未治療組（未治療組）、變應性鼻炎辣椒素治療組（治療組）。應用苦杏仁酸進行標記，用以區別分組。

1.2 藥物及試劑

卵清蛋白（Sigma公司生產）、氫氧化鋁粉末（Sigma公司生產）、辣椒素（Sigma公司生產）、P物質抗體[艾博抗（上海）貿易有限公司]。

1.3 動物模型建立方法

根據文獻[7-9]，建立AR大鼠動物模型：（1）OVA 基礎致敏階段：將卵清蛋白0.3 mg、氫氧化鋁粉末30 mg、生理鹽水1 mL混合制成混懸液，進行SD大鼠腹腔內注射，每間隔1日進行1次，共注射7次；（2）局部激發階段：基礎致敏階段結束后，予以2% OVA滴鼻，每側鼻腔50 μL，每日1次，共行7次滴鼻。

1.4 辣椒素干預

AR動物模型成功后，采用70%乙醇制成3.3 mmol/L的CAP溶液，再用蒸餾水稀釋成終濃度為0.656 μmol/L備用。予以辣椒素溶液滴鼻，每側鼻腔50 μL，每日1次，共15次。正常對照組、變應性鼻炎未干預組以等量生理鹽水替代辣椒素溶液，方法及步驟不變。

1.5 標本獲取及處理

1.5.1 獲取血液標本 在CAP溶液及生理鹽水最后一次鼻腔治療24 h內，將SD大鼠按照10%水合氯醛300 mg/kg的劑量腹腔注射麻醉后，暴露并分離腹主動脈，抽取動脈血5 mL，放入無菌EP管中，靜置1 h之后，于4℃環境下以3000 r/min轉速用離心機離心15 min后獲得上層血清，置于-20℃冰箱內保存。

1.5.2 獲取鼻黏膜組織標本 將取血后的大鼠迅速處死并切取頭部，取鼻中隔黏膜，4%多聚甲醛溶液固定24 h，常規石蠟包埋，制作切片。（1）常規HE染色，觀察鼻黏膜形態。（2）甲苯胺藍染色：肥大細胞計數。（3）免疫組織化學染色：常規脫蠟、水化、抗原修復（采用微波爐加熱法）、封閉、一抗孵育（一抗為免疫P物質抗血清）、二抗孵育（二抗為生物素標記的羊抗兔血清）、顯色、復染、分化、脫水、透明、封片，4℃保存。

1.6 統計學方法

采用SPSS19.0統計學軟件處理數據，計量資料以均數±標準差表示，兩組均數比較采用t檢驗，多組比較采用方差分析，P<0.05為差異具有統計學意義，P<0.01為差異具有高度統計學意義。

2 結果

2.1各組SD大鼠癥狀學評分結果

未治療組與治療組大鼠于末次鼻腔激發后30 min內均出現打噴嚏、流清涕、易怒好動、騷鼻、撓癢等現象，癥狀學評分>5分。未治療組出現癥狀10只，治療組出現癥狀10只，兩組均造模成功，正常組未出現打噴嚏等AR表現。各組大鼠末次激發后癥狀評分比較差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

辣椒素治療15 d后再次觀察記錄上述打噴嚏、流清涕等AR癥狀，未治療組癥狀明顯緩解為2只（20%），治療組癥狀明顯緩解為8只（80%），差異有統計學意義（P<0.05）。各組治療后癥狀評分比較差異有統計學意義（P<0.05），見表2。

2.2 HE染色

正常組：黏膜形態正常，炎癥細胞少見。未治療組：黏膜連續性中斷，纖毛出現倒伏甚至脫落，炎癥細胞明顯浸潤。治療組：黏膜上皮損傷情況明顯好轉，炎癥細胞明顯減少。見封三圖2。

2.3 甲苯胺藍染色

未治療組肥大細胞計數較正常組增多，差異有統計學意義（P<0.05）。治療組肥大細胞計數較未治療組明顯減少，差異有統計學意義（P<0.05）。見封三圖3及表3。

2.4 免疫組織化學染色

治療組較未治療組SP表達減少，差異有統計學意義（P<0.05）。見封三圖4及表4。

3 討論

AR主要是吸入過敏原后產生的一種特異性反應，目前理論認為這是一種IgE介導的Ⅰ型變態反應[10-11]。抗原激活漿細胞后產生IgE，并與肥大細胞結合，當抗原再次侵入時，致使肥大細胞脫顆粒，產生多種介質，主要有組胺、蛋白酶、白三烯等，其引起血管擴張、液體滲出增加、腺體分泌亢進[12]等反應。SP是NANC神經遞質，作為鼻部異樣感及反射神經的一個重要媒介，鼻黏膜受到刺激時，SP釋放增加，使得血管擴張、黏膜水腫、血漿外溢[13]。因此，SP對鼻黏膜環境的改變至關重要。SP和一些神經遞質、細胞因子在神經-免疫系統中的信息轉移中起作用，它們可以整合SP及其受體表達[14]。在炎癥反應中，炎癥細胞和介質激活來自周圍感覺神經末梢的SP，導致炎癥組織SP的表達增加，并且還可以通過自分泌SP增強炎癥反應。本次實驗研究表明，辣椒素治療組SP表達減少，而此次實驗大鼠所處的鼻炎階段為早期。早期變應性鼻炎反應發生在過敏原暴露的幾分鐘內，并且特征為打噴嚏、鼻癢和水性鼻涕，其主要由肥大細胞和嗜堿性細胞分泌的化學介質引起。本結果可以解釋為將辣椒素滴鼻可使致敏的大鼠減輕鼻神經源性炎癥的發展。

本研究發現連續辣椒素治療15 d，治療組鼻腔黏膜SP含量顯著降低，接近正常水平。未治療組鼻黏膜SP含量明顯高于正常對照組，提示SP在AR的發病中可能發揮了重要的作用。實驗表明，辣椒素能促進SP的大量釋放，引起鼻分泌增多，血管擴張，血流量增多。當反復多次大劑量應用辣椒素能使SP耗竭、SP能神經變性和阻滯。為此，我們將辣椒素作為SP能神經阻滯劑，通過對AR治療作用的觀察，證實辣椒素減低了AR實驗動物鼻部對變應原的超敏反應性。SP能神經的軸索反射機制可能在AR中發揮作用，已有實驗初步表明此機制與P物質能神經末梢的逆向傳導有關[15]。

綜上所述，通過本次實驗，SD大鼠的辣椒素治療是成功的，同時初步探討了其可能的作用機制，希望能夠為CAP應用于AR的臨床治療提供理論參考。

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（收稿日期：2017-04-02）