紅笛鯛（Lutjanus sanguineus）CD8基因的克隆與誘導表達

黃郁蔥梁秀全蔡雙虎魯義善簡紀常吳灶和

（1. 廣東海洋大學水產學院，湛江 524088；2. 廣東省水產經濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室，湛江 524088）

紅笛鯛（Lutjanus sanguineus）CD8基因的克隆與誘導表達

黃郁蔥1，2梁秀全1蔡雙虎1，2魯義善1，2簡紀常1，2吳灶和2

（1. 廣東海洋大學水產學院，湛江 524088；2. 廣東省水產經濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室，湛江 524088）

探討紅笛鯛（Lutjanus sanguineus）CD8基因的基本特性。應用同源克隆和cDNA末端快速擴增（Rapid amplification of cDNA ends，RACE）技術克隆了紅笛鯛CD8α和CD8β基因，并分析了其在不同組織的表達分布及免疫刺激物誘導后的表達模式。結果顯示，CD8α cDNA序列全長1 576 bp，編碼225個氨基酸。紅笛鯛CD8β基因cDNA序列全長為1 486 bp，編碼210個氨基酸。氨基酸序列分析結果顯示，CD8α和CD8β均由信號肽、免疫球蛋白超家族（Immunoglobulin superfamily，IgSF）可變區、鉸鏈區、跨膜區和胞漿區組成。熒光定量PCR（Real time quantitative PCR，qRT-PCR）分析顯示紅笛鯛CD8α和CD8β基因在胸腺表達量最高，其次為中腎、鰓、腸、皮膚、脾和頭腎。紅笛鯛頭腎淋巴細胞體外經LPS、ConA和PolyI:C刺激8 h后CD8α和CD8β表達量顯著上調（P<0.01）。哈維氏弧菌疫苗刺激24 h后鰓、頭腎、脾臟、和腸的表達量上升。

紅笛鯛；CD8；基因克隆；誘導表達

在高等脊椎動物，根據表面標志分子CD4和CD8分子表達不同，將成熟T淋巴細胞分為CD4+或CD8+T淋巴細胞兩個亞群，其中CD8+T淋巴細胞主要為細胞毒性T淋巴細胞（Cytotoxic T lymphocytes，CTL），是機體參與抗病毒、抗胞內微生物感染、抗腫瘤及抗移植排斥反應的主要效應細胞［1］。CD8分子是一種以αα同源二聚體或αβ異源二聚體形式存在的膜結合糖蛋白［2］。在哺乳動物中，αβ異源二聚體主要表達于成熟T淋巴細胞和胸腺細胞［2］，而αα同源二聚體僅表達于自然殺傷（Naturalkiller，NK）細胞［3］、γδT細胞［4］和腸上皮內淋巴細胞［5］。通過mRNA的不同剪接機制，在血清中尚存在著可溶型CD8α或CD8β鏈（sCD8）［7］，但其功能尚不清楚。CD8α和CD8β鏈均屬于免疫球蛋白超家族成員，由信號肽、胞外免疫球蛋白超家族（Immunoglobulin superfamily，IgSF）可變區、近膜端鉸鏈區、跨膜區和胞漿區組成［7］。

CD8分子在TCR介導的抗原肽-MHCI識別過程中與MHC I和β2-微球蛋白（β2m）相互作用而發揮共受體的功能。晶體結構研究表明CD8α通過A/B β折疊和胞外免疫球蛋白超家族可變區內的互補決定區與β2微球蛋白及MHC I分子的α2、α3 結構域進行結合，有助于穩定TCR與抗原肽-MHCI復合物的相互作用［1］。此外，CD8α鏈胞漿區存在一個保守的CXC基序，該基序結合并激活淋巴細胞特異性酪氨酸蛋白激酶p56lck［8］，繼而磷酸化CD3多肽鏈中的ITAM基序，從而誘導細胞毒性T淋巴細胞的快速活化［9］。CD8β鏈不含有CXC基序，但在T細胞的分化和成熟過程中同樣發揮重要作用［10］。亦有研究表明其參與細胞膜表面脂筏的形成［11］。

近年來，陸續開展了有關魚類的T細胞免疫的相關研究。2000年，Hansen等［12］在虹鱒（Oncorhynchus mykiss）中報道了第一個魚類CD8分子，隨后多種魚類如大西洋鮭（Salmo salar）［13］、鯽魚（Carassius auratus langsdorfii）［14］、舌齒鱸（Dicentrarchus labrax L.）［15］、大西洋庸蝶（Hippoglossus hi-ppoglossus）［16］、斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）［17］和鱖魚（Siniperca chuatsi）［18］的CD8分子先后得到克隆鑒定。研究也發現了魚類白細胞具有與哺乳動物CTL細胞相似的細胞毒功能［19］，如同種異體移植排斥反應和殺傷病毒感染的細胞。但與哺乳動物相比，魚類的T細胞免疫研究仍然處于初始階段，對于魚類CD8+T細胞的功能和其介導的信號轉導機制及其他T細胞標記物的聯系仍有待闡明。

紅笛鯛（Lutianus sanguineus）是我國南方重要的海水養殖魚種，然而近年來集約化養殖規模的不斷擴大和養殖環境日益惡化，受到病原侵襲導致病害頻繁爆發，對其養殖業造成了巨大的經濟損失。目前對魚病尚缺乏有效的防治手段，闡明魚類的免疫防御機制對于魚病防治具有重要的指導意義。然而，到目前為止尚未有紅笛鯛T細胞表面標志基因的報道。本研究克隆紅笛鯛CD8基因的cDNA全長，應用實時熒光定量PCR（Real-time quantitative PCR，qRT-PCR）分析CD8基因在健康紅笛鯛組織中的表達和哈維氏弧菌疫苗誘導后在紅笛鯛免疫相關組織中的表達變化，旨在為進一步研究紅笛鯛T細胞介導的免疫奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗魚及菌株 實驗用紅笛鯛（體質量80-100 g）購自湛江某海水養殖網箱，經檢測無病蟲害，健康活力好，于水溫25-28℃的水泥池中進行養殖，24 h連續充氧，每天早晚投喂商品飼料各1次，日換水量1/3，試驗前暫養1周。哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）強毒株分離自患病紅笛鯛并保存于本實驗室。

1.1.2 組織樣品采集 將哈維氏弧菌強毒株接種于TSB（2% NaCl）培養基中，28℃振蕩培養16 h，用平板計數法計數菌液濃度后，加入終濃度為0.3%的福爾馬林，28℃滅活48 h。經檢驗滅活完全后，6 000 r/min離心20 min去培養基后用無菌PBS（0.01 mol/L，pH 7.4）將菌苗濃度調整為1×109CFU/mL，置2-8℃保存待用。將試驗魚分成2組，刺激組每尾魚腹腔注射0.2 mL疫苗，對照組注射等量無菌PBS。于刺激后的4、8、12、24、48和72 h分別采集鰓、頭腎、脾臟和腸組織，每個時間點采集5尾紅笛鯛，投入RNAlater后于-80℃保存備用，收集的組織主要用于熒光定量PCR分析。另取5 尾健康紅笛鯛，分別取鰓、胸腺、頭腎、肝、脾、腸、中腎、

心臟、腦、皮膚和肌肉組織立即投入RNAlater后于-80℃保存備用，收集的組織主要用于CD8 cDNA克隆和組織分布分析。

1.1.3 頭腎淋巴細胞樣品采集 頭腎淋巴細胞分離參考Xu［17］和Guo［18］的方法稍加改動。分別取5尾健康紅笛鯛用MS-222麻醉后，75%酒精短暫浸泡消毒，無菌條件下取出頭腎，迅速置于RPMI1640（含100 U青霉素、100 μg/mL鏈霉素和0.5%胎牛血清），用無菌剪刀將其剪成小塊后置于100目的無菌細胞篩網上，用無菌注射器頭輕輕研磨頭腎組織，用RPMI1640沖洗篩網，制備成頭腎細胞懸液備用。吸取2 mL頭腎細胞懸液沿管壁小心緩慢地加到34%和51%不連續密度梯度Percoll分離液界面上。于4℃ 400 r/min離心30 min，小心吸取兩層Percoll細胞分離液中間層白細胞，用RPMI1640洗滌2次，將細胞懸液濃度調整為5.0×105，以每孔接種1 mL接種到24孔板中，25℃培養4 h后去除單核細胞和巨噬細胞等粘附細胞，收集細胞懸液，重新接種到新的24孔板中。試驗組每孔分別加入終濃度為10 μg/mL的 LPS、10 μg/mL ConA和50 μg/mL PolyI:C，對照組加入PBS，每種處理組設3個重復，分別于4、8、12和24 h取樣。將樣品于4℃ 500 r/min條件下離心10 min去除培養基，加入500 μL TRIzol于-80℃保存備用。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取和cDNA合成 按Trizol（全式金）說明書分別提取紅笛鯛各組織和細胞總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，紫外分光光度法檢測其純度和濃度，確保其OD260/OD280在1.8-2.0。各組織的總RNA按照PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa）說明書合成cDNA第一鏈，置-20℃保存待用。另取頭腎的總RNA，按SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit（TaKaRa）說明書分別合成用于3'與5'RACE的cDNA，置-20℃保存待用。

1.2.2 引物設計與基因部分序列擴增 根據GenBank上已有的硬骨魚類CD8α和CD8β核酸的保守區域設計簡并引物F與R（表1），運用降落PCR從紅笛鯛頭腎cDNA第一鏈中擴增紅笛鯛CD8α和 CD8β基因的部分序列。PCR反應條件如下：95℃預變性3 min，94℃ 30 s，62℃ 30 s，72℃30 s 5 個循環；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃30 s 5 個循環；94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 30 s 30個循環，72℃延伸6 min。PCR反應產物經1%瓊脂糖凝膠電泳切下目的條帶，使用GeneJET Kit（Thermo fisher scientific）進行回收，與pMD-19T Vector連接后轉化DH5α感受態，篩選陽性克隆送至深圳華大基因股份有限公司進行測序。

表1 實驗中所用的引物序列

1.2.3 3'RACE和5'RACE擴增 根據獲得的CD8α和CD8β基因部分序列設計特異性巢式引物用于3'RACE 和5'RACE（表1）。將3'CD8αF1、3' CD8βF1和5'CD8αR1、5'CD8βR1分別與UPM Mix引物進行3' RACE與5'RACE第一輪降落PCR。反應條件為：95℃預變性3 min，94℃ 30 s，70℃ 2 min 5個循環；94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 2 min 5個循環；94℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 2 min 20個循環，72℃延伸6 min，4℃保存。將第一輪PCR 產物稀釋20倍作為模板，將3'CD8αF2、3'CD8βF2和5'CD8αR2、5'CD8βR2分別與NUP 進行第二輪降落PCR，反應條件為：95℃預變性3 min，94℃ 30 s，65℃30 s，72℃ 2 min 35個循環，72℃延伸6 min。PCR產物回收和測序步驟同1.2.2。

1.2.4 生物學信息分析 使用在線Blast程序（http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行序列同源性比對和相似性分析；使用Genetyx 6.0和protparam（http:// web.expasy.org/protparam/）預測開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF）、分子量（Mw）和理論等電點（pI）等；在線軟件SignalP 3.0 Server（http://www. cbs.dtu.dk/services/SignalP）和TMHMM Server 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）分別預測信號肽和跨膜結構域；在線程序NetGlyc1.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc）和NetOGlyc（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/）預測N-糖基化和O-糖基化位點；運用SMART（http://smart. embl-heidelberg.de/）分析蛋白質功能結構域；使用ClustalX 2.0 及MEGA 6.0 軟件以鄰位相連法（Neighbor-joining）構建系統進化樹，自檢數為1 000。物種CD8分子序列號，見表2。

表2 不同物種CD8分子GenBank登錄號

1.2.5 熒光定量PCR和數據統計與分析 將cDNA第一鏈稀釋5倍后用作qRT-PCR的模板，根據CD8α和CD8β基因ORF設計引物reCD8αF、reCD8αR和reCD8βF、reCD8βR（表1），以β-actin為內參基因，利用ABI7300實時熒光定量PCR儀對紅笛鯛CD8α和CD8β基因的表達量進行分析，每個樣本設3個重復。PCR反應條件為：94℃預變性3 min，94℃變性20 s，60℃退火20 s，60℃延伸20 s，40 個循環。采用2ˉΔΔCt法計算紅笛鯛CD8α和CD8β基因的相對表達量，應用SPSS 11.0軟件對數據進行進行ANOVA單因素方差分析和Tukey HSD多重比較。

2 結果

2.1 序列特征分析

紅笛鯛CD8αcDNA全長為1 576 bp（GenBank登錄號：KF285563），包含94 bp 5' 非翻譯區（Untranslated Region，UTR）、804 bp 3' UTR和678 bp ORF。其ORF推導編碼225個氨基酸，預測的分子量和等電點分別為24.90 kD和9.44，無N-糖基化位點。紅笛鯛CD8βcDNA全長為1 486 bp（GenBank登錄號：KF285564），包含74 bp 5' UTR、779 bp 3' UTR和633 bp ORF。其ORF 推導編碼210個氨基酸，預測的分子量和等電點分別為23.58 kD 和9.81，含有1個N-糖基化位點。SignalP 4.1 Server和TMHMM Server V. 2.0預測顯示CD8α和CD8β氨基酸序列均屬于I型跨膜蛋白分子，由信號肽、免疫球蛋白超家族（Immunoglobulin superfamily，IgSF）可變區、胞外區、跨膜區和胞漿區5個結構域組成。

2.2 氨基酸序列比較及系統發育分析

將紅笛鯛CD8α和GenBank已登錄的其他動物的CD8α進行氨基酸序列同源性比對，結果見圖1和圖2。其中紅笛鯛CD8α和舌齒鱸的CD8α同源性最高，達62.5%，與哺乳動物和鳥類的同源性較低，為20.5%-23.0 %。紅笛鯛CD8β和鱖魚的CD8β同源性最高，達73.0%，與哺乳動物和鳥類的同源性較低，為23.9%-28.1%。氨基酸序列多重比對發現，包括紅笛鯛在內的魚類CD8α和CD8β的IgSF可變區和鉸鏈區分別含有一對保守的Cys殘基，而且鉸鏈區富含Thr、Ser和Pro殘基，形成多個O-糖基化位點。此外，CD8α和CD8β的胞漿區均無p56lck的結合位點CXC基序，但分別含有魚類中高度保守的RTRRCPHHYKR和LPKKCRH基序（圖1，圖2）。利用MEGA 6.0的Neighbor-Joining法構建CD8氨基酸序列系統進化樹，結果（圖3）顯示，CD8α和 CD8β分別形成兩個獨立的進化分支，在CD8α分支上，紅笛鯛與硬骨魚鱸形目的舌齒鱸聚在一起，表明它們親緣關系最近。在CD8β分支上，紅笛鯛與鱖魚和斜帶石斑魚聚在一起，表明它們親緣關系最近。在兩個分支上紅笛鯛均與鳥類和哺乳類遺傳距離較遠，這與blastp的結果一致。

2.3 CD8在健康紅笛鯛組織中的分布

應用qRT-PCR技術檢測CD8α和CD8β在健康紅笛鯛不同組織中的相對表達水平，分析結果（圖4）顯示，CD8α和CD8β在各組織均有不同程度的表達，其中CD8α和CD8β均在胸腺的表達量最高，CD8α在中腎、鰓、腸、皮膚、脾和頭腎組織中表達量次之，CD8β則在中腎、鰓、腸、皮膚、肌肉和心組織中表達量次之；其他組織表達量較低。

圖1 紅笛鯛CD8α與其他脊椎動物CD8α氨基酸序列比較

圖2 紅笛鯛CD8β與其他脊椎動物CD8β氨基酸序列比較

2.4 淋巴細胞體外刺激后CD8α和CD8β的表達模式

應用qRT-PCR檢測了紅笛鯛頭腎淋巴細胞體外經LPS、ConA和PolyI∶C刺激后CD8α和CD8β的表達變化。結果（圖5，圖6）顯示，在試驗期內，LPS處理組的表達量與對照組無明顯上升（P>0.05）。ConA和PolyI:C處理組的CD8α和CD8β的表達量于刺激后4 h顯著升高（P<0.05），并于8 h達到最高（P<0.01），然后開始快速下降，于24 h內回歸到基礎表達水平。

2.5 滅活哈氏弧菌刺激紅笛鯛后CD8 mRNA的表達分析

應用qRT-PCR檢測了哈維氏弧菌疫苗刺激紅笛鯛4、8、12、24、48和72 h后CD8α和CD8β的mRNA在紅笛鯛鰓、頭腎、脾臟和腸的表達變化。結果（圖7，圖8）顯示，在哈氏弧菌疫苗刺激4 h后，CD8α和CD8β mRNA表達量開始輕微上調表達，在鰓和腸中于12 h達到最高（P<0.05），在頭腎和脾臟中的表達量于24 h達到最高，顯著高于對照組（P<0.05），然后開始緩慢下降，72 h后回落到基礎表達水平。

3 討論

作為MHC I類限制性T細胞識別抗原的輔助受體，CD8分子在T細胞增殖和分化的信號轉導中起重要作用。本研究獲得了紅笛鯛CD8α和CD8β基因的cDNA全序列，分別編碼225和210個氨基酸，與已發現的其他魚類和哺乳動物的CD8結構相類似，均由信號肽、IgSF可變區、鉸鏈區、跨膜區和胞漿區組成。盡管與哺乳動物的同源性較低，但仍具有一些高度保守的氨基酸殘基、糖基化位點和功能基序，對CD8分子的正確折疊和執行功能起關鍵作用［20］。

圖 3 基于NJ 法構建的CD8α和CD8β氨基酸序列系統進化樹

圖5 頭腎淋巴細胞體外經LPS、ConA 和PolyI：C刺激后CD8α mRNA的表達變化

氨基酸序列多重比較顯示，紅笛鯛CD8α和 CD8β的IgSF可變區均包含一對保守的半胱氨酸，用以形成結構域內二硫鍵［21］。鉸鏈區同樣存在一對保守的半胱氨酸殘基，參與同源二聚體（在一對保守的半胱氨酸殘基形成結構域內二硫鍵度［22］，預示魚類CD8分子與哺乳動物的CD8同樣可二聚化形成二聚體。值得注意的是，大部分硬骨魚CD8α的跨膜區及CD8βDIgSF可變區均含有額外兩個保守的半胱氨酸殘基，然而，對于它們的功能尚未清楚，有待進一步研究加以闡明。此外，紅笛鯛CD8鉸鏈區富含Thr、Ser和Pro，而且含有多個潛在的O-糖基化位點，有助于其保持伸展狀態從而提高與TCR和MHC I的α3結構域結合能力［21］，增強其輔助受體功能［23］。

跨膜區和胞漿區在所有物種中均相對保守，其中含有較多帶正電荷的氨基酸殘基和一些保守基序［15］。高等哺乳動物和鳥類的CD8分子胞漿區含有CXC基序，該基序通過形成鋅扣結構結合絡氨酸蛋白激酶p56lck［24］，參與T細胞活化增殖信號的轉導，但包括紅笛鯛在內的硬骨魚中均未發現，代之為CXH基序。Moore等［13］推測Cys和His同樣可通過形成相似的鋅扣結構將p56lck激酶連接到胞漿區尾部，但Turner等［8］也發現用Ala殘基替換第二個Cys殘基后會降低p56lck激酶與CXC基序的親和力。盡管目前的研究表明表明魚類CD8+T細胞可發揮細胞毒功能［19，25］，但是魚類中p56lck激酶與魚類CD8分子胞漿區中的保守基序的結合方式和結合能力仍未清楚，有待進一步研究。

本研究發現除了CD8β在頭腎和脾臟組織中表達量較低外，CD8α和CD8β mRNA在其余組織中的表達模式較相似，二者的表達量均在胸腺中最高，是其他組織表達量的10-800倍，與其在大西洋鮭［13］、舌齒鱸［15］、大西洋庸鰈［16］和鱖魚［17］等魚類的研究結果相似。胸腺是魚類中樞免疫器官，CD8在胸腺中的高表達再次表明胸腺是T淋巴細胞產生、成熟和分化的場所。脾臟和頭腎是魚類重要的外周免疫器官，中腎是魚類的排泄器官，其中的造血組織間同樣含有T淋巴細胞［26］，研究發現T淋巴細胞散在分布于其中參與系統免疫應答［27］。此外，發現CD8在紅笛鯛皮膚、腸和鰓中等也具有較高的的表達量，與在大西洋鮭［13］和金銀鯽［14］、舌齒鱸［15］的發現相一致，可能是由于在黏膜相關淋巴組織內存在一定數量的CD8陽性細胞［28］，表明CD8分子在局部黏膜免疫應答中發揮重要作用。

LPS是一種經典的促B細胞活化的有絲分裂原，頭腎淋巴細胞體外經LPS刺激后CD8在各時段的表達量沒有改變，與小鼠T淋巴細胞的研究結果相同［29］，表明其不能誘導CD8+T細胞增殖。經ConA和PolyI∶C刺激后CD8均顯著上調表達，其表達模式與鱖魚的CD8分子的表達模式相似［18］。而PolyI∶C是一種雙鏈RNA病毒類似物，可激活細胞毒性T細胞和NK細胞。ConA通過有絲分裂原受體與T淋巴細胞結合刺激其增殖，研究表明河豚的CD8 陽性細胞在ConA和PHA刺激下顯著增殖［30］，此外還可刺激人外周血單核細胞中CD8持續上調表達［31］。因此，推測魚類的CD8陽性細胞具有哺乳類CD8陽性細胞部分相似的特性。

圖6 頭腎淋巴細胞體外經LPS、ConA和PolyI：C刺激后CD8β mRNA的表達變化

圖7 哈維氏弧菌免疫后CD8α mRNA在鰓、頭腎、脾和腸組織中的表達水平

圖8 哈維氏弧菌免疫后CD8β mRNA在鰓、頭腎、脾和腸組織中的表達水平

本實驗中哈維氏弧菌疫苗免疫12 h后CD8α和CD8β在頭腎、脾臟、鰓和腸中均有一定程度的上調表達，與耶爾森氏菌疫苗免疫虹鱒后的研究結果相似［32］。在牙鲆感染愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）和病毒性出血性敗血癥病毒（Viral hemorrhagic septicemia virus，VHSV）后也出現CD8出現表達水平顯著升高的現象［33］。CD8是細胞毒性T淋巴細胞的標記分子，病原感染后表達量升高表明引起CD8陽性細胞活化增殖參與細胞免疫應答，但它們在免疫反應過程中的作用和調節機制仍有待進一步研究。此外，本研究中紅笛鯛的CD8α和CD8β mRNA在健康狀態及感染后組織表達模式非常相似，預示組織中的CD8αβ可能以異二聚體形式存在相同的細胞中表達，Kato等［33］發現牙鲆CD8α和CD8βmRNA存在于脾和頭腎中的相同細胞簇中，Takizawa等［34］使用單克隆抗體鑒定虹鱒CD8α+細胞同時表達CD8β mRNA，該兩項研究提供了CD8αβ異二聚體陽性細胞存在的間接證據。本研究克隆了CD8α和CD8β基因，為進一步制備單克隆抗體、分選CD8+T細胞以及細胞毒性T淋巴介導的的免疫應答研究奠定了基礎。

4 結論

本研究克隆獲得了紅笛鯛CD8α和CD8β基因，均由信號肽、免疫球蛋白超家族可變區、鉸鏈區、跨膜區和胞漿區組成，健康紅笛鯛CD8α和CD8β基因在胸腺中表達量最高，其次為中腎、鰓、皮膚、脾、頭腎和腸。紅笛鯛頭腎淋巴細胞CD8α和CD8β體外經LPS、ConA和PolyI:C刺激后表達量上調。哈維氏弧菌疫苗免疫24 h后鰓、頭腎、脾臟、和腸的CD8α和CD8β表達量上升。

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（責任編輯 狄艷紅）

Molecular Cloning and Induced Expression Analysis of CD8 Gene from Humphead Snapper

HUANG Yu-cong1，2LIANG Xiu-quan1CAI Shuang-hu1，2LU Yi-shan1，2JIAN Ji-chang1，2WU Zao-he2
（1. Fisheries College of Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088；2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals，Zhanjiang 524088）

This work aims to characterize CD8 gene of humphead snapper，Lutjanus sanguineus. The full length cDNA sequences of CD8α and CD8β genes were cloned by homologous cloning and rapid amplification of cDNA ends（RACE）from humphead snapper，and their tissue distribution and expression pattern after induction with immunostimulants were also analyzed by real time quantitative PCR（qRT-PCR）. The CD8α’s cDNA consisted of 1 576 bp encoding 225 amino acids，and the CD8β’s cDNA consisted of 1 486 bp encoding 210 amino acids. The predicted CD8α and CD8β proteins were similar in structure，both contained a signal peptide，immunoglobulin superfamily variable domain，hinge region，transmembrane domain and cytoplasmic tail. The qRT-PCR analysis showed that the highest level of CD8α and CD8β mRNA expression was found in thymus，followed by kidney，gill，intesine，skin，spleen，and head kidney. Furthermore，the mRNA levels of CD8α and CD8β in head kidney leucocytes was significantly up-regulated after 8 h treated with the stimulants lipopolysaccharide（LPS），concanavalin A（ConA），and polyinosinic-polycytidylic acid（PolyI∶C），respectively（P < 0.01）. And their expression levels in gill，anterior kidney，spleen，and intesine also increased at 24 h after stimulated with formalin-inactivated Vibrio harveyi.

Lutjanus sanguineus；CD8；gene cloning；induced expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0095

2017-02-16

廣東省自然科學基金（2016A030313748），廣東省海洋經濟創新發展區域示范專項（GD2012-B01-004），大學生創新創業訓練計劃（CXXL2014020），廣西海洋生物技術重點實驗室開放基金（GLMBT- 201404）

黃郁蔥，男，博士，研究方向：水產動物免疫學及病害控制；E-mail：hyczjou@163.com

簡紀常，教授，博士生導師，研究方向：水產動物免疫學及病害控制；E-mail：jianjc@163.com