蛋白激酶BIN2的純化及活性分析

袁敏齊玉榮王瑞菊

（1. 華北理工大學生命科學學院 基因組學與計算生物學研究中心，唐山 063000；2. 河北師范大學生命科學學院，石家莊 050024）

蛋白激酶BIN2的純化及活性分析

袁敏1齊玉榮2王瑞菊2

（1. 華北理工大學生命科學學院 基因組學與計算生物學研究中心，唐山 063000；2. 河北師范大學生命科學學院，石家莊 050024）

BIN2是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在油菜素內酯（BR）信號轉導中發揮重要作用。為了獲得具有激酶活性且不帶標簽的BIN2蛋白，將BIN2基因構建到帶eXact標簽的pPAL8表達載體上，獲得BIN2基因的原核表達載體eXact-BIN2，轉化大腸桿菌表達菌株BL21（DE3）。摸索合適的誘導條件后成功誘導出51 kD 的eXact-BIN2蛋白。經eXact純化介質純化并切除標簽，獲得質量較高、不帶標簽的BIN2蛋白。該BIN2蛋白具有較高的激酶活性，能夠在體外磷酸化MBP-BZR1蛋白。

BIN2；磷酸化；蛋白激酶；蛋白純化

BIN2（Brassinosteroid Insensitive 2）是類糖原合成酶激酶3（Glycogen synthase kinase 3，GSK3）家族的成員。GSK3是一類在真核生物中非常保守的基因家族，廣泛參與調控眾多的生物學過程，具有典型的結構特征，從N端到C端依次由可變域、保守激酶域及C末端域組成［1，2］。擬南芥中GSK-LIKE家族共有10個成員，依據序列同源性又可細分為4個亞家族，其中BIN2是II亞家族中的AtSK21。擬南芥GSK-LIKE成員在植物BR（Brassinosteroid，油菜素內酯）信號轉導，生長素信號轉導、花發育、側根的發育、非生物脅迫響應和氣孔發育等多方面發揮重要作用［3-9］。

在擬南芥中BIN2作為負調控因子參與BR信號通路。BR是一種重要的植物內源激素，在植物細胞伸長，維管組織分化，植物的抗逆抗病等諸多生長發育過程中發揮重要作用，它是目前公認的繼生長素、赤霉素、細胞分裂素、脫落酸、乙烯之后被發現的第六大類植物激素。BR合成缺失突變體或對BR不敏感的突變體表現為植株矮小、葉片暗綠及暗中光形態建成等表型［10，11］。近年來，關于BR信號轉導方面的研究一直是生物學領域研究的熱點問題之一，并且取得了很多重大的科研成果，鑒定出了很多參與BR信號轉導的組分，BR 通過一條磷酸化信號轉導通路調節基因表達。當植物體內BR濃度較低時，BIN2持續磷酸化轉錄因子BZR1（Brassinazole Resistant 1）和BES1（bri1-Ethylmethane Suppressor 1）。隨著BR濃度升高，BIN2的活性受到抑制，失活的BIN2不能繼續磷酸化下游的BZR1和BES1，而BZR1和BES1會被蛋白磷酸酶PP2A（Protein Phosphatase 2A）去磷酸化進而調控下游基因的表達。在這一系列的蛋白質可逆磷酸化修飾過程中，激酶BIN2與磷酸酶PP2A相互配合控制核心轉錄因子BZR1/BES1的磷酸化狀態在BR信號轉導通路中發揮十分重要的作用［12-16］。近年來的研究表明，BIN2可以磷酸化并抑制MAPKKK（YDA）活性而參與植株氣孔發育［4，17］。BIN2在BR信號轉導與植株氣孔發育的交叉互作中發揮核心作用。基于BIN2功能的重要性，純化BIN2蛋白并解析其晶體結構將更有助于理解其結構與功能的關系。

目前，純化蛋白通常利用融合表達的親和標簽，獲得帶有標簽蛋白的融合蛋白。常用的標簽有兩類：一類是一些多肽表位，能夠與固定在樹脂上的分子配體或多肽結合。如Flag 標簽，生物素受體多肽標簽以及鈣調蛋白結合多肽標簽等；另一類是能夠與固定在層析介質上的小分子配體結合的大蛋白標簽，如GST，MBP標簽等。無論哪種標簽都會干擾蛋白的生物學活性，影響其晶體結構。通常情況下可以用一種高度特異性的蛋白內切酶切割和去除標簽，但是這些蛋白酶對不同蛋白質的切割效率差異很大，并且蛋白切割操作步驟比較復雜，很可能在切割過程中對蛋白造成影響，比如蛋白質變性、降解等。本研究中利用Bio-Rad公司的Profinity eXact 純化系統很好的解決了上述問題。該系統把eXact標簽與固定在純化介質上的突變的絲氨酸蛋白酶結合，利用鹵素離子氟離子或者疊氮化鈉在標簽和目的蛋白之間剪切，使標簽滯留在純化介質上，而目的蛋白從層析柱上洗脫下來。蛋白洗脫與切割一步完成，切割下來的目的蛋白不含有eXact純化標簽的殘留，能夠保持目的蛋白本身的生理特性［18-20］。本研究擬利用Profinity eXact 純化系統來純化不帶標簽的、且具有較好激酶活性的BIN2蛋白，為進一步研究其蛋白晶體結構及生物學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

基因克隆所用酶類及試劑購于康為世紀公司；IPTG誘導劑購于Sigma公司；eXact純化介質購于美國Bio-Rad 公司。

1.2 方法

1.2.1 BIN2基因的克隆及eXact-BIN2原核表達載體的構建 利用BIN2的基因特異引物擴增獲得其全長基因。將BIN2擴增片段與空載體pPAL8分別用SpeⅠ和NotⅠ雙酶切，回收目的條帶，經連接酶連接后轉化大腸桿菌DH5α。挑取一些克隆進行雙酶切鑒定，選取酶切鑒定的陽性克隆測序。測序正確的重組載體eXact-BIN2轉化大腸桿菌BL21（DE3）。1.2.2 IPTG誘導濃度、誘導溫度和誘導時間對eXact-BIN2蛋白表達的影響 將轉化eXact-BIN2重組載體的BL21大腸桿菌在LB液體培養基中培養過夜，1∶200擴培后繼續培養至菌液OD600在0.6-0.8之間，分別使用終濃度為0.1 mmol/L和0.5 mmol/L的IPTG，在37℃、30℃和23℃ 3種不同溫度下誘導1-6 h收集菌體。SDS-PAGE電泳檢測eXact-BIN2蛋白表達情況，確定合適的IPTG濃度、誘導溫度以及誘導時間。

1.2.3 BIN2蛋白的純化 利用eXact介質進行純化。收集經IPTG誘導的菌體，棄去上清，用樣品緩沖液（0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液，pH7.2）重懸菌體，超聲破碎后，14 000 r/min 4℃離心15 min。收集上清液與eXact介質低溫混勻1-2 h。1 500-2 000 g/min離心，棄去上清。用加入0.2% Triton-X100的樣品緩沖液洗滌eXact介質數次除去雜蛋白。利用蛋白洗脫緩沖液（0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液，pH7.2，0.1 mol/L NaF）與eXact介質孵育5-10 min，離心收集洗脫液，重復洗脫多次。取0.5-1 μg獲得的蛋白進行SDS-PAGE電泳，檢測蛋白純化效果。

1.2.4 體外蛋白激酶試驗 準備50 mmol/L Tris.HCl，pH7.4，10 μmol/L ATP，1 mmol/L MgCl2作為激酶反應液。將1 μg BIN2蛋白與0.5 μg MBP-BZR1蛋白加入到激酶反應液中至總體系20 μL，室溫孵育10-30 min。然后利用SDS-PAGE電泳通過分析電泳遷移率的變化判斷MBP-BZR1是否被BIN2磷酸化。蛋白質被磷酸化后，分子量變大，電泳時遷移速度變慢，使用合適濃度的蛋白分離膠可以區分出磷酸化前后蛋白質分子量的差異。因此，可以通過分析底物蛋白質在激酶反應前后的電泳遷移情況來判斷MBPBZR1是否被BIN2磷酸化。

2 結果

2.1 BIN2基因的克隆及eXact-BIN2原核表達載體的構建

利用基因特異性引物擴增獲得1 143 bp的BIN2全長基因（圖1-A），經SpeⅠ和NotⅠ雙酶切鑒定獲得大約1 000 bp的小片段和大約6 000 bp的大片段，分別與基因片段和空載體大小相符。再利用SpeⅠ進行單酶切鑒定，獲得大約7 000 bp 的片段，與BIN2基因加空載體的總大小相符（圖1-B）。挑取克隆測序后獲得正確的eXact-BIN2原核表達載體。

圖1 eXact-BIN2原核表達載體的構建

2.2 IPTG誘導濃度、誘導溫度和誘導時間對BIN2蛋白表達的影響

將轉化eXact-BIN2重組載體的BL21大腸桿菌分別使用終濃度為0.1 mmol/L和0.5 mmol/L的IPTG，在37℃、30℃和23℃ 3種不同溫度下誘導1-6 h收集菌體。SDS-PAGE檢測結果（圖2）表明，誘導的eXact-BIN2融合蛋白為51 kD，并且該蛋白對誘導條件的要求并不十分嚴格，在37℃、30℃和23℃溫度下eXact-BIN2蛋白表達量均較高，0.1 mmol/L和0.5 mmol/L IPTG的誘導效果也沒有明顯差異。

圖2 不同誘導條件下eXact-BIN2融合蛋白的表達

2.3 BIN2蛋白的純化

經過摸索，確定IPTG誘導濃度為0.1 mmol/L，然后在37℃、30℃和23℃溫度下分別對BIN2蛋白進行誘導和純化。SDS-PAGE表明獲得的eXact-BIN2融合蛋白純度質量均較高，洗脫后切除eXact標簽的BIN2蛋白分子量大小為43 kD（圖3）。測定蛋白濃度，發現37℃誘導后純化的蛋白濃度較低，為93.4 μg/L；30℃誘導后純化的蛋白濃度為420.4 μg/L；23℃誘導后純化的BIN2蛋白濃度最高，為997.2 μg/L，可能是23℃誘導時產生的可溶性BIN2蛋白量最多。

2.4 蛋白激酶BIN2能夠磷酸化MBP-BZR1

將試驗所獲得的BIN2蛋白通過體外蛋白激酶試驗檢測其活性，結果如圖4所示，跟孵育前的MBP-BZR1（泳道2）相比，與BIN2共同孵育后的MBP-BZR1分子量變大，電泳遷移變慢，表明MBPBZR1已經被BIN2磷酸化成為磷酸化狀態的BZR1（pBZR1）（泳道3）。泳道1為單獨的MBP蛋白，泳道4為單獨的BIN2蛋白。

圖3 切除eXact標簽的BIN2蛋白的洗脫結果

圖4 BIN2能夠體外磷酸化MBP-BZR1

3 討論

可逆磷酸化是一種重要的蛋白質翻譯后修飾方式，廣泛參與植物體內細胞分裂和伸長、激素信號轉導、植物對逆境脅迫的反應、光合作用和衰老等眾多生物學過程。植物體內蛋白激酶種類很多，BIN2作為一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于GSK3家族成員，對其大部分底物都以負調節的作用方式發揮作用。BIN2通過磷酸化BZR1在BR信號轉導通路中發揮負調控作用［12］。

研究蛋白質修飾的試驗中經常會利用標簽來純化目的蛋白，然而，標簽蛋白作為融合蛋白的一部分會一起被純化出來，并且標簽的大小、親疏水性，以及帶電荷情況都會對目的蛋白的表達、可溶性以及活性等方面產生影響。為了避免標簽的干擾，獲得更接近生理條件下的蛋白，純化不帶標簽的蛋白是一種非常重要的手段。不帶標簽的蛋白可以通過純化后對融合蛋白進行標簽剪切獲得，但是分離去除標簽蛋白操作步驟比較復雜，并且可能在剪切過程中導致蛋白質變性、降解等。Bio-Rad公司的Profinity eXact 純化系統將蛋白洗脫與蛋白切割一步完成，切割下來的目的蛋白不含有純化標簽，能夠保持目的蛋白本身的生理特性。這是與傳統的蛋白純化標簽相比而具有的一個極大的優點［19，20］。本研究獲得的不帶標簽的BIN2蛋白保留了很好的激酶活性，能夠在體外磷酸化底物MBP-BZR1蛋白。在純化過程中，多次重復試驗，收集的第一管蛋白洗脫液中都含有一個分子量大約70 kD的蛋白，推測可能是對維持BIN2正確構象與激酶活性密切相關的伴侶蛋白，也可能是與純化介質非特異結合的雜蛋白。

4 結論

本研究成功構建了eXact-BIN2原核表達載體，誘導出51 kD的eXact-BIN2融合蛋白。利用eXact純化介質成功獲得了不帶標簽的，大小約為43 kD的BIN2蛋白，該BIN2蛋白具有較好的激酶活性，能夠在體外磷酸化底物MBP-BZR1蛋白。

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（責任編輯 狄艷紅）

Purification and Activity Analysis of Tag- free Protein Kinase BIN2

YUAN Min1QI Yu-rong2WANG Rui-ju2
（1. Center for Genomics and Computational Biology，College of Life Sciences，North China University of Science and Technology，Tangshan 063000；2. College of Life Sciences，Hebei Normal University，Shijiazhuang 050024）

BIN2 is a kind of Ser/Thr protein kinase，and plays important roles in BR signal transduction pathway. In order to obtain the active and tag-free BIN2 protein，the BIN2 gene was cloned into the prokaryotic expression vector pPAL8 to obtain BIN2-pPAL8 expression vector. The correct plasmid BIN2-pPAL8 was transformed into E.coli expression strain BL21（DE3）. After exploring the proper induction conditions，the 51 kD eXact-BIN2 protein was successfully induced and purified using eXact purification system. The high-quality and tag-free BIN2 protein was obtained through cleaving the eXact tag. The purified BIN2 protein is highly active，which could phosphorylate MBP-BZR1 in vitro.

BIN2；phosphorylation；protein kinase；protein purification

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1167

2016-12-26

國家自然科學基金項目（31401212，31201063），河北省自然科學基金（C2014209134，C2012205042）

袁敏，女，博士，研究方向：植物生長發育；E-mail：yuanmin308@163.com

王瑞菊，女，博士，研究方向：植物激素信號轉導；E-mail：15100149962@126.com