一種根癌農桿菌介導的耐鹽椒樣薄荷含芽莖段轉化系統

趙忠娟 魏艷麗 李紀順 王貽蓮 楊合同

（山東省科學院生態研究所，濟南 250014）

一種根癌農桿菌介導的耐鹽椒樣薄荷含芽莖段轉化系統

趙忠娟 魏艷麗 李紀順 王貽蓮 楊合同

（山東省科學院生態研究所，濟南 250014）

椒樣薄荷的轉基因技術是提高精油產量和品質的重要手段，為解決耐鹽椒樣薄荷葉片不定芽誘導過程中易褐化，難分化，不適合作為轉基因外植體的問題，利用含芽的椒樣薄荷莖段作為外植體建立了一種根癌農桿菌介導的外源基因轉化體系。利用正交試驗對轉化所用的根癌農桿菌菌液濃度、轉化時間和共培養時間進行優化，結果顯示：3個因素對轉化效果的影響作用表現為轉化時間（B）>菌液濃度（A）>共培養時間（C），篩選出的最優轉化條件為菌液濃度為OD600=0.8，轉化時間為15 min，共培養時間為3 d。對不同轉化液組分進行優化篩選，結果獲得最適的轉化液組分為：1/5MS+ 0.5 g/L MES（2-（N-嗎啡啉）乙磺酸）+1%葡萄糖+2%蔗糖，PH5.4。利用不同植物表達載體進行轉化，并通過基因組PCR和GUS染色進行轉化植株的陽性檢測，結果表明該轉化體系適用于多種植物表達載體的轉化，容易獲得再生植株，為耐鹽椒樣薄荷的基因轉化提供新的方法與體系。

椒樣薄荷；莖段；根癌農桿菌；植物表達載體；基因組PCR；GUS染色

椒樣薄荷（Mentha piperita L.）是唇形科薄荷屬多年生草本植物，別名歐洲薄荷、胡椒薄荷、黑薄荷，系水薄荷（Mentha aquatica）和綠薄荷（Mentha spicata）雜交而成的六倍體不育系，至今已有250年［1］。椒樣薄荷的主要產品薄荷精油含薄荷酮、薄荷醇、乙酸薄荷酯等118 種有效成分，香氣純正，清爽宜人，具有清涼特性和鎮痛作用，被廣泛應用于食品、醫藥和日用化妝品行業［2-4］。“科院1號”是本研究室篩選出，可在黃河三角洲地區大規模推廣種植的耐鹽椒樣薄荷，該椒樣薄荷對NaCl脅迫具有較強的耐受性，并具有較好的脫鹽效果［5-7］。

農桿菌（Agrobacterium）是一類生活在植物根的表面，依靠根組織滲透出來的營養物質生存的，普遍存在于土壤中的革蘭氏陰性細菌。農桿菌具有天然感染植物細胞的能力，可以誘發植物冠癭瘤。農桿菌中存在一種巨大質粒，稱為Ti質粒。Ti質粒可作為外源基因的載體，介導外源基因的轉化［8，9］。目前農桿菌介導的遺傳轉化已經廣泛應用于雙子葉植物和單子葉植物中，應用的農桿菌主要為根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）和發根農桿菌（Agrobacterium rhizogenes）2種。

根癌農桿菌介導的轉化方法主要有整體植株接種共感染法［10］和葉盤轉化法［11］。葉盤轉化法是由Horsch等發展起來的一種轉化方法，其操作過程中利用打孔器從消毒葉片上取得葉圓片，亦稱之葉盤［11］。后來這一共培養系統被廣泛用于幼胚［12］、葉片［13］、莖切段［14］、子葉切段［13，15］、下胚軸切段［15，16］、萌動胚［17］、愈傷組織［18］、懸浮培養細胞［19］等離體材料的轉化。目前，根癌農桿菌介導的椒樣薄荷轉化多采用葉盤法，外植體主要為葉片［20-22］。本研究室前期研究發現，以葉片作為外植體建立耐鹽椒樣薄荷再生體系比較困難，葉片容易褐化且分化效率較低。相比而言，含有腋芽的莖段分化和獲得再生植株較容易，可以用來作為根癌農桿菌介導轉化的外植體。本研究利用含芽的椒樣薄荷莖段作為外植體，對轉化所需的根癌農桿菌菌液的濃度、轉化時間、共培養時間和轉化液組分等條件進行優化篩選，建立一種利用耐鹽椒樣薄荷莖段作為外植體的根癌農桿菌介導外源基因轉化體系，且該轉化體系適用于多種植物表達載體的轉化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 本實驗所用椒樣薄荷為本研究室前期篩選的耐鹽椒樣薄荷“科院1號”的無菌苗，所用根癌農桿菌菌株為GV3101，所用轉化載體為植物表達載體pCAMBIA1304和pB2GW7。

1.1.2 培養基與轉化液 本實驗所用的培養基見表1。所用轉化液主要成分為MS基礎培養基、MES、葡萄糖和蔗糖，各成分含量如表2所示。

1.2 方法

1.2.1 椒樣薄荷莖段預培養 將耐鹽椒樣薄荷無菌苗去掉莖部葉片，用無菌剪刀剪成長度大約為1-2 cm的含腋芽的莖段，用無菌刀片在腋芽處輕輕劃幾刀，暴露損傷部位，然后將莖段放入預培養的培養基中，用鋁箔紙包裹避光，（25±3）℃黑暗條件下預培養3 d。

1.2.2 根癌農桿菌介導的外源基因轉化 將-80℃保存的含有植物表達載體pCAMBIA1304和pB2GW7的根癌農桿菌GV3101按1∶100接種到含有50 mg/L利福平和50 mg/L卡那霉素（pCAMBIA1304）或100 mg/L 壯觀霉素（pB2GW7）的10 mL YEP液體培養基中，30℃，200 r/min過夜震蕩培養，將活化的菌液再按照1∶50重新接種到含有50 mg/L利福平和50 mg/L卡那霉素或100 mg/L 壯觀霉素的50 mL YEP液體培養基中，30℃，200 r/min震蕩培養16-18 h。將活化的菌液置于滅菌的50 mL離心管中，5 000 r/min離心5 min，收集菌體，用轉化液重懸菌體，5 000 r/min離心5 min，洗滌菌體，然后再次用轉化液重懸菌體，調整OD600為0.6-1.0，加入30 mg/L AS（乙酰丁香酮），備用。將預培養3 d的耐鹽椒樣薄荷莖段置于重懸的根癌農桿菌菌液中，抽真空8-15 min，黑暗條件下，30℃，200 r/min震蕩培養30 min。

表1 實驗所用培養基配方

表2 轉化液組成成分與含量

1.2.3 轉化材料共培養并誘導再生植株產生 將抽真空轉化的耐鹽椒樣薄荷莖段從根癌農桿菌菌液中取出，用無菌濾紙吸去表面殘留的菌液，置于共培養培養基上，（25±3）℃ 暗培養3-7 d。然后將耐鹽椒樣薄荷莖段用含有100 mg/mL頭孢霉素的無菌水清洗3-4次，用無菌濾紙吸干多余水，轉至不定芽誘導培養基上，（25±3）℃，16 h光照/8 h黑暗條件下對椒樣薄荷莖段進行抗生素篩選和不定芽的誘導。抗生素篩選后未發黃顏色仍為綠色的不定芽轉移至生根誘導培養基上誘導生根，產生再生植株。統計不定芽在抗生素篩選培養基中的存活率。

存活率（%）=存活的不定芽數目/莖段誘導產生不定芽數目×100% 1.2.4 轉化條件優化 本研究利用L9（34）正交試驗對菌液濃度（OD600=0.6、0.8、1.0）、抽真空時間（8、10、15 min）和共培養時間（3、5、7 d）進行優化，篩選出最合適的菌液濃度、抽真空時間和共培養時間的組合（表3）。在篩選出最適組合的基礎上，利用不同轉化液重懸菌體，篩選最適的轉化液組分。每種轉化液轉化椒樣薄荷莖段30個，抗生素篩選后計算不定芽存活率，選擇最適的轉化液，實驗重復3次。

表3 L9（34）正交試驗因素水平表

1.2.5 基因組PCR驗證植株陽性 兩種表達載體pCAMBIA1304和pB2GW7利用轉化液2和轉化液6進行轉化，經抗生素篩選獲得的陽性植株，生長至7-8個葉時，從植株上剪取2-3片葉片，用CTAB法提取耐鹽椒樣薄荷基因組DNA。以基因組DNA為模板，利用35S引物（35S-F：TGTAGAGAGAGACTGGTGATTTCAG，35S-R：TATTGGCTAGAGCAGCTTGCCA）進行PCR驗證。并利用載體質粒作為陽性對照，未轉化的耐鹽椒樣薄荷基因組DNA作為陰性對照。

1.2.6 陽性植株GUS染色檢測 植物表達載體pCAMBIA1304含有GUS報告基因，可以利用GUS染色技術檢測含植物表達載體pCAMBIA1304的根癌農桿菌轉化椒樣薄荷后的陽性植株。GUS染色方法為：（1）取材，固定：剪取轉基因耐鹽椒樣薄荷植株的莖段，加-20℃保存的90%丙酮，沒過材料即可，冰浴20 min。（2）漂洗：用漂洗液（0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液，2.5 mmol/L K3Fe（CN）6，2.5 mmol/L K4Fe（CN）6）漂洗3次。（3）染色：加入X-Gluc染色液（100 mg X-Gluc用9.58 mLDMSO溶解，溶解液200 μL加入5 mL漂洗液即為染色液），抽真空5min，37℃染色2 h以上。（4）觀察：用70%酒精清洗染色后莖段，用體視顯微鏡觀察GUS染色結果并拍照。

2 結果

2.1 農桿菌介導的椒樣薄荷莖段轉化

根癌農桿菌介導的椒樣薄荷轉化如圖1所示，椒樣薄荷含芽莖段較易生成不定芽，且生成的不定芽生長迅速，容易生根獲得陽性植株。轉化周期大約3個月，轉化效率最高可以達到8.14%。

圖1 椒樣薄荷莖段轉化系統

2.2 農桿菌轉化條件優化

利用L（934）正交試驗對轉化條件進行優化篩選，結果（表4）表明，正交優選轉化條件為A2B3C1，即使用OD600=0.8的根癌農桿菌菌液，抽真空轉化15 min，共培養3 d時轉化效果最好，不定芽存活率為21.9%。同時由正交試驗結果的R值分析發現，菌液濃度（A）、轉化時間（B）和共培養時間（C）3個因素對轉化效果的影響作用表現為（B）>（A）>（C）。

2.3 轉化液組分的優化

所用轉化液的主要組分為MS培養基、MES、蔗糖和葡萄糖，對各組分的配比進行優化，共使用9種不同配方的轉化液對椒樣薄荷莖段進行轉化，結果（表5）顯示：4種組分都含有的轉化液2和6轉化后抗生素篩選的存活率分別為16.6±1.86%和19.9±2.20%，轉化效果明顯優于缺少任何一種組分的轉化液。轉化液2和6的差別在于MS基本培養基的濃度，二者相比轉化液6的轉化效果優于轉化液2的轉化效果，說明所用的9種轉化液中，最適的轉化液組分為1/5MS+ 0.5 g/L MES+1%葡萄糖+2%蔗糖，pH 5.4。

表4 L9（34）正交試驗結果

表5 不同轉化液對轉化效果的影響

2.4 轉基因植株的陽性檢測

兩種表達載體pCAMBIA1304和pB2GW7，利用不同轉化液進行轉化，植株利用基因組PCR進行檢測分析，結果如圖2，陽性植株和陽性對照（質粒）PCR擴增得到一條約900 bp的條帶，說明外源載體已經轉入椒樣薄荷基因組中，擴增結果未獲得條帶的株系為抗生素篩選時出現的假陽性。

pCAMBIA1304載體轉化的椒樣薄荷莖段，用轉化液2轉化的莖段分化不定芽數為198，用抗生素篩選獲得植株數目為16，利用基因組PCR檢測陽性植株為7株，轉化率為3.54%；用轉化液6轉化的莖段分化不定芽數目為236，用抗生素篩選獲得植株24株，PCR檢測陽性植株為16株，轉化率為6.78%（圖2-A、2-B，表6）。

pB2GW7載體轉化的椒樣薄荷莖段，用轉化液PCR驗證獲得的陽性轉基因幼苗進行GUS染色鑒定，結果（圖3）顯示，PCR驗證獲得的陽性植株GUS染色為藍色，能夠檢測到GUS表達，進一步驗證了基因組PCR檢測的正確性。

表6 不同植物表達載體轉化后PCR鑒定獲得的轉化率

3 討論

椒樣薄荷作為重要的油料作物，薄荷精油為其最主要產品。利用基因工程和代謝工程提高薄荷精油的含量與品質一直是研究的熱點。有研究人員通過將薄荷醇合成途徑中基因進行超表達來提高精油含量的方法進行了評價和分析［23］，該研究中利用椒樣薄荷葉片作為外植體進行薄荷醇合成途徑中各基因的轉化，將整個葉片浸泡在根癌農桿菌菌液中，滲透轉化后切除葉片基部包含葉柄的部分在不定芽誘導培養基上誘導產生愈傷組織和不定芽［20，22］。本實驗室篩選獲得的耐鹽椒樣薄荷，因為葉片含有大量的多糖，在體外不定芽誘導過程中很容易褐化，再生頻率低，利用葉片作為外植體進行外源基因轉化難以實現。因為腋芽分生組織細胞全能性較強，易誘導不定芽的產生，本研究選用含芽的莖段作為外植體，通過根癌農桿菌介導的外源基因轉化，建2轉化莖段數為68，獲得的不定芽數為98，用抗生素篩選獲得植株數目為8，利用基因組PCR檢測陽性植株為5株，轉化率為5.10%；用轉化液6轉化的莖段數為50，分化不定芽數目為86，用抗生素篩選獲得植株12株，PCR檢測陽性植株為7株，轉化率為8.14%（圖2-C、2-D，表6）。

兩種載體轉化獲得的轉化率存在一定差異，pB2GW7載體轉化率略高于pCAMBIA1304載體，但兩者相差不大，都有較高的轉化率。兩種轉化液介導的轉化效果也存在差異，轉化液6的轉化率高于轉化液2，與上述轉化液組分優化結果相符（表6）。

pCAMBIA1304載體中含有GUS報告基因，對立了一種新的椒樣薄荷轉化體系。該轉化體系的轉化效率最高可達到8.14%，明顯高于利用葉片作為外植體的轉化效率（1.0%）［20］。

根癌農桿菌介導的外源基因轉化體系中，影響轉化效率的因素有很多，其中菌液濃度、轉化時間和共培養時間是大量外源基因轉化的研究中關注的重要因素［18，24］。本研究也對這幾個因素進行了優化，同時通過正交試驗對3個因素對轉化效果的影響大小進行了分析，結果表明：3個因素對轉化效果的影響作用表現為轉化時間（B）>菌液濃度（A）>共培養時間（C）。

轉化液也是影響轉化效率的重要因素，但目前對轉化液組分的研究較少，僅有少量添加的AS濃度對轉化效率影響的研究，研究表明，AS作為信號分析可以誘導根癌農桿菌的vir基因活化及高效表達，從而促進外源基因整合到植物基因組中［24］。本研究對含有不同組分的轉化液的轉化效率進行比較分析，結果表明外源基因轉化耐鹽椒樣薄荷的體系中，MS、MES、蔗糖和葡萄糖4種組分俱全的轉化液能夠獲得最高的轉化效率。其中MS為外植體提供營養，是轉化液中重要的組分，其濃度也能影響椒樣薄荷莖段的轉化效率。MES作為一種生物緩沖劑，能調節氫離子濃度的變化，維持轉化液的pH［25］，轉化液中缺失MES會降低轉化效率，說明轉化液的PH對轉化效率有重要影響。轉化液中的蔗糖和葡萄糖通過不同比例的搭配為轉化提供合適的滲透環境。

圖2 利用基因組PCR對pCAMBIA1304和pB2GW7載體轉基因植株進行陽性檢測

圖3 利用GUS染色對含pCAMBIA1304載體的轉基因植株陽性進行檢測

4 結論

利用椒樣薄荷莖段作為外植體，通過對菌液濃度、轉化時間、共培養時間和轉化液組分的優化，建立了一種根癌農桿菌介導的耐鹽椒樣薄荷莖段轉化體系。該轉化體系最優轉化條件為：菌液濃度為OD600=0.8，抽真空時間為15 min，共培養時間為3 d；最適的轉化液為：1/5MS+ 0.5 g/L MES+1%葡萄糖+2%蔗糖，pH 5.4。該體系適用于多種植物表達載體的轉化，容易獲得再生植株，可以運用于椒樣薄荷基因轉化，為利用基因工程提高椒樣薄荷精油含量與品質提供一種新的轉化方法。

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（責任編輯 朱琳峰）

An Efficient Transformation of Salinity-resistant Peppermint Stem Mediated with Agrobacterium tumefaciens

ZHAO Zhong-juan WEI Yan-li LI Ji-shun WANG Yi-lian YANG He-tong
（Ecology Institute of Shandong Academy of Sciences，Jinan 250014）

Transgenic technology is an important means to improve the essential yield and quality of peppermint（Mentha piperita L.）oil. An Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation using bud peppermint stem was established，in order to solve the problems in adventitious bud induction of salinity-resistant peppermint leave，such as easy browning and difficult differentiation. The orthogonal test was carried out to screen the optimal concentration of A. tumefaciens，transformation time and co-culture time. The results showed that the effect of the three factors on transformation displayed as the transformation time（B）> bacterial concentration（A）> co-culture time（C）. The bacterial concentration OD600= 0.8，the transformation time 15 min and the co-culture time 3 d proved to be the optimal transformation conditions. The optimal composition of transformants was screened to be 1/5MS + 0.5 g/L MES（2-（N-morpholino）ethanesulfonic acid）+ 1% glucose + 2% sucrose and PH 5.4. The transformation was conducted using different plant expression vectors，and the positive plants were detected by genomic PCR and GUS staining. And the results revealed that this transformation system was suitable for the transformation of many plant expression vectors，and the regenerated plants were easily obtained. This provides a new method and system for gene transformation of salinity-resistant peppermint.

peppermint；stem；Agrobacterium tumefaciens；plant expression vector；genomic PCR；GUS staining

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1199

2017-01-07

山東省科技重大專項（重大關鍵技術）項目（2015ZDJS03002），山東省重點研發項目（2015GNC111015），楊合同黃河三角洲學者項目，山東省農業良種工程項目

趙忠娟，女，博士，研究方向：耐鹽植物選育；E-mial：zzjfrances@aliyun.com

楊合同，男，博士，研究員，研究方向：耐鹽植物與應用微生物；E-mial：yanght@sdas.org