海南地不容中總生物堿的提取及含量測定

程莎+莫國平+戴華+白麗麗

摘 要 采用正交試驗法優選海南地不容的提取工藝并進行含量測定。以提取的總生物堿為考察指標，醇的體積分數、提取功率、提取時間、次數、料液比分別為考察因素，設計正交試驗確定超聲提取總生物堿的最優工藝。以鹽酸小檗堿為對照品，利用分光光度法在418 nm處測定海南地不容中總生物堿的含量。最佳工藝為醇體積分數80%、超聲提取30 min、功率160 W、料液體積比1∶20、提取2次。小檗堿在0.0～18.0 μg/mL范圍內線性關系良好（r=0.999 4）。平均回收率為99.03%，RSD=2.38%（n=6）。總生物堿含量可達到4.67%。確定的提取工藝簡單，用時少，提取率高。建立的測量方法簡單、靈敏度高、重現性好，適用于海南地不容中總生物堿的含量測定。

關鍵詞 海南地不容 ；總生物堿 ；提取 ；含量 ；正交試驗

中圖分類號 S567.236 ；R284 文獻標識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.06.017

Extraction and Determination of Total Alkaloids from

Stephania hainanensis

CHENG Sha1） MO Guoping1） DAI Hua2） BAI Lili1）

（1 School of Pharmaceutical Sciences， Hainan Medical University， Haikou， Hainan 571199；

2 School of Public Health， Hainan Medical University， Haikou， Hainan 571199）

Abstract An orthogonal experiment was designed to screen an optimum method for extraction of total alkaloids from Stephania hainanensis. The total alkaloids extracted was used as an index， and ethanol volume fraction， extraction time， altrasonic power， extraction frequency were used as factors to design the orthogonal experiment to optimize the altrasonic extraction of the total alkaloids from S. hainanensis. The content of total alkaloids extracted was determined by using spectrophotometry at 418 nm with berberine hydrochloride as a reference substance. The extraction was identified optimum when the volume fraction of ethanol was 80%， the extraction time was 30 min， the altrasonic power was 160 W， the solid-liquid ratio was 1：20， and the extraction frequency was 2 times. Berberine hydrochloride had a good linear relationship （r=0.999 4） at the range of 0～18.0 μg/mL. The average recovery was 99.03% （RSD=2.38%）. The content of total alkaloids extracted was 4.67%. This extraction technology was proved to be simple， time saving and higher in extraction rate. The determination method for total alkaloids was easy， highly sensitive and good in repeatability， and can be used for determination of the content of total alkaloids from S. hainanensis.

Keywords Stephania hainanensis ； total alkaloids ； extraction ； determination ； Orthogonal experiment

地不容（Stephania Hainanensis Lo et Y Tsoong）又名金不換、山烏龜、金錢吊，是防己科千金藤屬草質藤本，屬海南特有植物。生于海南島大山石縫、峭壁、亂石堆的半陰處或溪邊叢林中[1]。地不容作為海南黎族的傳統醫藥，味苦而辛，性涼，有小毒，具有清熱解毒、鎮靜、理氣、止痛等功效[2]。國內外對該屬植物化學成分和藥理活性的研究較多[3-6]，但有關海南地不容總生物堿的提取以及含量測定卻鮮有報道。據文獻報道，海南地不容中主要含有嗎啡型生物堿、阿撲啡型生物堿、原小檗堿型生物堿和異喹啉型生物堿等[3，7]。生物堿由于其抑菌[8]、消炎、鎮痛、抗腫瘤[9]及促進免疫功能等生物活性，成為近年來研究的熱點之一。有關生物堿的提取方法有多種[10]，利用超聲技術可以縮短提取時間、提高提取率，并且無需加熱，提高了熱敏性生物堿的提取率，且對其生理活性基本無影響。本文探索超聲法提取海南地不容總生物堿的最優工藝，以鹽酸小檗堿為對照品，采用紫外分光光度法測定總生物堿的含量，為進一步研究和開發海南地不容的藥用價值提供基礎研究數據。

1 材料與方法

1.1 材料

地不容藥材采自海南興隆，經海南醫學院曾念開教授鑒定為防己科千金藤屬（Menispermaceae Stephania）海南地不容（S. hainanensis）塊根，晾干，粉成細粉，備用。

試驗所用儀器：KQ-200KDE型高功率數控超聲清洗器（昆山超聲儀器有限公司）、RE-201D旋轉蒸發儀（上海科升儀器有限公司）、UV1600型紫外可見分光光度計（北京瑞利分析儀器有限公司）、B210S分析天平（北京賽多利斯有限公司）、PHS-3C型酸度計（上海精密科學儀器有限公司）；試劑：鹽酸小檗堿（上海源葉生物科技有限公司，批號B21449）；溴甲酚綠（天津市鼎盛鑫化學試劑公司），檸檬酸（天津大茂化學試劑廠），檸檬酸鈉（天津大茂化學試劑廠），三氯甲烷，無水乙醇、氫氧化鈉均為國產分析純，水為蒸餾水。

1.2 方法

1.2.1 相關溶液配制

1.2.1.1 對照品溶液配制

精密稱定在110℃干燥至恒重的鹽酸小檗堿20 mg，置于25 mL容量瓶中，加蒸餾水至刻度線，搖勻；精密量取上述溶液2.5 mL于10 mL容量瓶中，加蒸餾水至刻度線，搖勻，得200 μg/mL的對照品溶液。

1.2.1.2 顯色液和緩沖液的配制

參照文獻[6]配制溴甲酚綠酸性染料溶液以及pH=5.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液。

1.2.1.3 供試品溶液配制

精密稱定海南地不容粉末2.0 g，分別加入70%乙醇，120 W功率，超聲提取30 min，提取2次，濃縮后經氯仿提取，于50 mL容量瓶中定容，搖勻，低溫冷藏儲存，備用。

1.2.2 方法學考察

1.2.2.1 吸收波長的選擇

精密量取鹽酸小檗堿對照品溶液與供試品溶液各0.3 mL，置分液漏斗中，加檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液5 mL，溴甲酚綠溶液2 mL，搖勻，加入氯仿10 mL，充分振搖，靜置1 h，分出氯仿層后，于300～600 nm波長范圍內進行掃描，同時以氯仿作為空白參比液。

1.2.2.2 線性關系考察

精密量取鹽酸小檗堿對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.5、0.7、0.9 mL加水0.9、0.8、0.7、0.5、0.3、0.1 mL按1.2.2.1項操作，充分振搖后，靜置1.5 h，分出氯仿層，在418 nm處測定吸光度值，同時以氯仿作為空白對照。

1.2.2.3 穩定性考察

取對照品0.3 mL，按1.2.2.1項操作后在，室溫條件下密閉放置，分別在0、10、15、30、60、90、120 min時測定于418 nm處吸光度。

1.2.2.4 精密度試驗

精密量取對照品溶液0.3 mL，按1.2.2.1項操作后，平行測6次，以空白溶液作為參比。

1.2.2.5 重復性試驗

取0.3 mL供試品溶液6份，按1.2.2.1項操作后，依次測定吸光度值，以空白溶液作為參比。

1.2.2.6 加標回收試驗

取0.3 mL供試品溶液6份，分別加入對照品溶液0.1 mL，按1.2.2.1項操作后，分別測定吸光度值。

1.2.3 提取工藝篩選

分別考察乙醇的體積分數、提取時間、提取功率、提取次數和料液比對總生物堿提取率的影響，并在此基礎上設計正交試驗確定超聲提取法的最優工藝。

2 結果與分析

2.1 波長的選擇

取對照品溶液與空白參比溶液分別于300～600 nm波長范圍內進行掃描。結果表明：鹽酸小檗堿對照品溶液在418 nm處有最大吸收峰，而空白參比溶液在418 nm處沒有吸收，故本實驗選定418 nm為測定波長。

2.2 線性關系考察

精密量取對照品溶液于418 nm處測定吸光度，以吸光度值（A）縱坐標，濃度（μg/mL）為橫坐標繪制標準曲線，如圖1所示，線性回歸方程為A=0.077+0.051 C，相關系數r=0.999 4。結果表明：鹽酸小檗堿在0.0～18.0 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.3 方法學考察

2.3.1 穩定性試驗

取對照品溶液分別在0、15、30、60、90、120 min平行測定6次后，得其RSD=1.70%（n=6）。結果表明：小檗堿在0～120 min內可以保持穩定，滿足試驗的要求。

2.3.2 精密度試驗

取對照品溶液平行測定6次后，得其RSD=0.70%（n=6），結果表明儀器精密度良好，符合試驗的要求。

2.3.3 重復性試驗

取供試品溶液平行測定6次后，得其RSD=1.56%（n=6），表明重現性良好，符合試驗的要求。

2.3.4 加標回收試驗

如表1所示，回收率為96.76%～102.60%，平均回收率為99.03%，RSD=2.38%（n=6）。結果表明，本實驗方法具有良好的回收率，滿足試驗的要求。

2.4 單因素試驗

2.4.1 乙醇體積分數對提取效果的影響

由圖2-A可知，隨著乙醇體積分數的增大，海南地不容中總生物堿的提取率先降低后逐漸增大，在乙醇體積分數為80%時提取率有最大值。生物堿與乙醇體積分數呈非線性關系，乙醇濃度過高或過低都不利于生物堿的提取，且濃度過高，提取成本也明顯增加，因此，選定60%、70%、80%作為正交的3個合理水平。

2.4.2 超聲功率對提取效果的影響

由圖2-B可知，隨著超聲功率的增大，總生物堿的提取率先增大，隨后開始減小，再增大。在超聲功率為200 W時提取率達到最大值。從節能的角度考慮，超聲功率不宜過高，所以選定120、160、200 W為正交的3個合理水平。

2.4.3 超聲時間對提取效果的影響

由圖2-C可知，隨著超聲時間的增加，總生物堿的提取率逐漸增大，在超聲時間為40 min時提取率有最大值，之后，超聲時間對提取率的影響不大。因此，選定30、40、50 min作為正交的合理水平。

2.4.4 提取次數對提取效果的影響

由圖2-D可知，當提取次數超過2次后，總生物堿的提取率趨于平穩。從經濟及效率的角度考慮，提取次數為2次較為理想，不再進行優化。

2.4.5 提取料液比的影響

由圖2-E可知，隨著料液比增大，總生物堿的提取率先增大后減小，當料液比為1∶20時，達到最大值，再增加料液比沒有增加提取率，反而造成試劑的浪費。因此，選定料液體積比1∶15、1∶20、1∶25作為正交的合理水平。

2.5 正交設計試驗

根據單因素實驗結果，優選4個因素設計正交試驗，因素與水平見表2。正交試驗結果見表3，方差分析見表4。

對表3結果進行直觀分析和方差分析可知，極差大小顯示各因素的影響作用依次為乙醇體積分數（A）>提取功率（C）>提取時間（B）>料液比（D），乙醇的體積分數（A）和提取功率（C）對地不容中總生物堿的提取有顯著影響，提取時間（B）和料液比（D）對提取影響較小。從直觀分析圖中可看出，時間因素B1和B3對提取影響不是很明顯，從節能和效率的角度考慮選擇B1較為理想。因此，綜合直觀分析和方差分析的結果，確定海南地不容中總生物堿的最優提取工藝為：A3B1C2D2，即乙醇的體積分數為80%，超聲提取30 min，功率為160 W，料液比為1∶20，提取2次。

2.6 工藝驗證及總生物堿含量測定

為進一步考察最優工藝的穩定性，精密稱取地不容粉末2.0 g，3份，按照最優工藝提取得供試品溶液，測得海南地不容中總生物堿含量平均為4.67%，RSD=1.58%（n=6）。

2.7 回流法提取生物堿

精密稱定地不容粉末約2.0g，3份，置于圓底燒瓶中，用30mL乙醇加熱回流2h，提取2次。過濾，用氯仿萃取，顯色，定容，測定總生物堿的含量為2.58%，RSD=2.01%（n=3）。

3 討論

本研究采用超聲法提取海南地不容中的總生物堿，通過單因素試驗及正交試驗法確定超聲提取總生物堿的最優工藝為乙醇的體積分數為80%，超聲提取30 min，功率為160 W，料液比為1∶20，提取2次。與加熱回流提取法比較，超聲法操作簡單、用時少、節能環保、提取效率高。采用酸性染料比色法于紫外-可見分光光度計上測定總生物堿含量，由于氯仿可有效萃取生物堿-溴甲酚綠離子對，因此選定為萃取劑，但在測定吸光度值時，氯仿極易揮發，故應快速測定，以免影響測量結果。本研究建立的測量方法簡單、靈敏度高、重現性好、測定結果準確，可用于地不容中總生物堿的含量測定。本研究探索的超聲提取方法可為進一步開發和利用海南地不容的藥用價值提供科學依據。

參考文獻

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