表面電荷對聚乙二醇修飾金納米粒子生物行為的影響

付宇++李曉東++李鑄衡++陳宏達++王振新++張惠茅++王海峰

摘要利用硫金鍵將末端修飾甲氧基、氨基或羧基的巰基化聚乙二醇（Thiolated polyethylene glycol，HSPEG）分子分別組裝到金納米粒子表面， 合成了3種帶有不同表面電荷的聚乙二醇修飾金納米粒子（PEGylated gold nanoparticles，PEGAu NP）。細胞共培養和小鼠尾靜脈注射實驗結果表明，表面電荷能夠顯著影響PEGAu NP的生物行為。細胞對PEGAu NP的吞噬量遵循正電荷

Symbol～@@ 電中性

Symbol～@@ 負電荷的規律。尾靜脈注射的PEGAu NP能夠隨小鼠的血液循環由全器官分布逐漸向肝脾轉移。表面帶負電荷的PEGAu NP較難被小鼠肝脾清除，帶但正電荷的PEGAu NP能夠引起小鼠免疫系統較強的響應。

關鍵詞聚乙二醇； 金納米粒子； 活細胞； 活體分布； 生物相容性

1引 言

金納米粒子（Gold nanoparticles，Au NPs）因具有光學性質可調、易通過SAu配位實現功能化等優點而被認為是構建診療一體化納米探針及納米藥物的理想材料＼[1～6＼]。盡管基于Au NPs的納米藥物具有療效高和副作用低的優點，但其生物安全性仍存在很多爭議＼[7～9＼]。一些研究表明，Au NPs具有毒性效應，且與納米粒子的大小、表面電荷及功能團高度相關＼[9～13＼]。如粒徑（Dcore）< 2 nm的Au NPs具有顯著細胞毒性；Dcore>10 nm的Au NPs細胞毒性則較弱，并隨Dcore增大稍有增加。由于Dcore在10～100 nm 范圍內的Au NPs能夠自由進出細胞，并選擇性進入特定細胞器，因此Au NPs有可能干擾細胞器的正常生理功能，具有潛在的細胞毒性＼[11～13＼]。Dcore相同的Au NPs，正電荷的Au NPs的細胞毒性高于電中性或負電荷的Au NPs。此外，通過配體交換或進一步功能化，同樣能夠改變Au NPs的細胞毒性。Deol等＼[14＼]將樹枝狀分子接枝到谷胱甘肽修飾的Au NPs表面改善其細胞毒性。

隨著Au NPs在生物醫學和生物分析中的應用日益廣泛，其相關毒理學數據不斷豐富；但是大量、離散的實驗設計， 導致相互矛盾的Au NPs毒性數據＼[7～13＼]。Goodman等＼[15＼]證明正電荷的2 nm Au NPs的細胞毒性大于電中性及負電荷的Au NPs。但Schaeublin等＼[16＼]發現無論是正電荷或負電荷的2 nm Au NPs均具有細胞毒性，并且負電荷的Au NPs的毒性更高。與大多數研究結果相反，Vetten等＼[17＼]發現20 nm Au NPs能夠顯著降低中國倉鼠卵巢細胞的活率。Yang等＼[18＼]認為不同Dcore 的Au NPs對小鼠均無生物毒性，然而Fraga等＼[19＼]發現20 nm Au NPs能夠導致小鼠輕度貧血。另外，Au NPs的物理化學性質對其在活體器官中分布、遷移影響的研究相對較少＼[20，21＼]。為了充分揭示Au NPs的毒理學特征，需要系統評估Au NPs的理化性質與生物毒性的關系。本研究以生物相容性好的聚乙二醇（PEG）為基本配體單元，僅通過改變PEG末端的功能團獲得3種帶有不同表面電荷的PEG修飾的13 nm Au NPs， 系統考察了表面電荷對Au NPs與細胞相互作用及其在小鼠體內分布的影響。研究結果表明，表面電荷在細胞對Au NPs的吞噬和器官對Au NPs的富集過程中起重要作用。

2實驗部分

2.1儀器、試劑與材料

UVmini1240紫外可見吸收光譜儀（日本島津公司）； ELAN 9000/DRC電感耦合等離子體質譜（ICPMS，美國熱電公司）； HITACHI H600型透射電子顯微鏡（TEM，日本Hitachi公司），5415R型高速離心機（德國Eppendorf公司）； NanoZS粒度儀（英國Malvern公司）； LEICA EM UC7型超薄切片機（德國LEICA公司）； Power Wave XS2 型微孔板分光光度計（美國BioTek儀器有限公司）。

氯金酸（HAuCl4·3H2O，美國SigmaAldrich公司）； 檸檬酸鈉（Na3C6H5O7·2H2O，北京化工廠）； HSPEGNH2、HSPEGOCH3、HSPEGCOOH（其中PEG部分MW2000，美國Nanocs公司）； 3（4，5二甲基噻唑2）2，5二苯基四氮唑溴鹽（MTT）、二甲亞砜（DMSO）、青霉素和鏈霉素（上海鼎國生物技術有限公司）； DMEM培養基和胎牛血清（FBS）（美國Gibco公司）； HeLa（人宮頸癌細胞），THP1（人單核細胞），HepG2（人肝癌細胞），A549（人肺癌細胞）和293（人胚腎細胞）細胞株（中國科學院上海細胞庫）； 其它試劑均為分析純，購于北京國藥集團； 實驗用水為MilliQ（美國Millipore公司）制備的超純水（18.2 MΩ·cm）。BalB/C小鼠（雌性，4～5周齡，約20 g體重，北京華阜康生物科技股份有限公司）。

2.2PEG修飾的金納米粒子的合成與表征

參考TurkevichFrens＼[22，23＼]方法制備檸檬酸根保護的13 nm Au NPs。將3種PEG化合物按照Au NPs與PEG 摩爾比1∶5000分別加入10 mL Au NPs溶液中，室溫下反應12 h后，將溶液離心（9000 r/min離心15 min）清洗3次，以除去未反應的PEG。將純化后的PEG修飾Au NPs（PEGAu NP）分散于1 mL H2O中儲存于4℃備用。根據PEGAu NP所帶電荷的不同將其命名為G13X，其中G代表Au NPs，13代表Au NPs的粒徑，字母X=C、N、A，分別代表帶正電（Cationic）、中性（Neutral）和帶負電（Anionic）的PEGAu NP。

2.3細胞毒性和吞噬實驗

在37℃下，5% CO2培養箱中， 使用包含10% FBS、100 IU/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的DMEM培養基以1 × 104 cell/mL 的密度將5種細胞（THP1、HeLa、MCF7、Hep G2和A549）接種于96孔板中。過夜孵育細胞后，更換含有不同濃度G13X（0，25，50和100 μg/mL）的新鮮培養基， 繼續培養24 h。后去除含G13X的培養基，在200

SymbolmA@ L新鮮培養基中添加10 μL MTT （5 mg/mL）繼續培養4 h，形成的甲瓚結晶用100 μL DMSO 溶解。用微型孔板分光光度計測量490 nm 處的吸光度值， 以未與G13X共培養的細胞為對照組， 相對細胞活率=（＼[A＼]test/＼[A＼]control）×100%。

為了檢測細胞對不同G13X的吞噬量，將不同細胞種入6孔板，并用不含血清的培養基培養24 h。去除培養基后，將100

SymbolmA@ L含有100 μg/mL G13X的新鮮培養基分別加入到孔板內繼續培養24 h。吸出培養基，并用100

SymbolmA@ L PBS清洗細胞3次，將細胞用胰蛋白酶消化并轉移至離心管計數后離心（1000 r/min），得到細胞沉淀，凍干后用濃HNO3溶解，使用ICPMS測定金元素含量。

2.4金納米粒子活體內分布和毒性實驗

所有動物使用小鼠專用飼料和無菌水于清潔級環境（吉林大學實驗動物中心）中飼養，動物實驗均遵循吉林大學動物實驗中心對動物實驗的相關規定。

金納米粒子活體體內分布：將實驗用小鼠分為3組，對應3種Au NPs，每組9只小鼠。首先用10%（V/V）水合氯醛麻醉小鼠，尾靜脈注射200 μL含有4 mg/kg G13X的生理鹽水。在特定時間點（注射后1、7和30天）選取3只小鼠，稱重后處死，取出心、肝、脾、肺、腎、腦和骨髓等器官。稱量器官重量后，用王水消化2 h得到液體，使用ICPMS測定器官中金元素的含量。使用未經Au NPs處理的3只小鼠作為對照組。

采用TEM觀察肝、脾組織：通過尾靜脈向小鼠體內注射200 μL含有4 mg/kg G13C的注射液。注射30天后將小鼠處死，快速取出肝和脾組織，經2.5%戊二醛前固定、1%鋨酸后固定、乙醇系列脫水和Epon812環氧樹脂包埋處理后，使用LEICA EM UC7型超薄切片機半薄切片定位后做超薄切片，然后用醋酸雙氧鈾及檸檬酸鉛雙重染色，用TEM觀察及攝片。

Au NPs毒性實驗：按上述相同方法處理小鼠，在注射G13X后1、7和30 天分別抽取血液用于血常規和ICPMS測試； 每個時間點將3只小鼠處死，取出心、肝、脾、肺、腎和腦等器官，使用10%（V/V）福爾馬林中性緩沖液固定，取部分組織，用Hematoxylin&Eosin染色，在顯微鏡下觀察并拍攝圖片。以正常飼養的小鼠作為對照組。

3結果與討論

3.1金納米粒子合成與表征

Au NPs的UVvisible光譜和TEM表征如圖1所示。所合成的檸檬酸根保護的Au NPs的平均粒徑為（13.2±2.5） nm，最大表面等離子體共振（Surface plasmonic resonance， SPR）吸收峰為519 nm，與文獻＼[22，23＼]報道的值一致。經PEG修飾后，G13X的UVvisible光譜沒有發生顯著變化，說明納米粒子沒有發生大規模的聚集。TEM表征也證明， G13X具有良好的分散性。表1給出了所合成的G13X在不同介質中的表面電荷（Zeta potential，ZP）和水合粒徑（Hydrodynamic size，HD）。由于在G13X表面存在雙電層，在純水和磷酸鹽緩沖溶液（PBS）中G13X的水合粒徑比TEM所測得的粒徑稍大。FBS中含有大量不同種類的蛋白質，能夠通過自組裝、靜電吸附等相互作用在G13X表面形成一層蛋白質，因此在含有10%血清的PBS中， G13X的水合粒徑遠大于其在純水和PBS中的水合粒徑＼[24，25＼]。另外，帶正電荷的G13X能夠通過靜電作用吸附大量帶負電荷的蛋白質，其表面電勢由正電荷轉變為負電荷。

3.2Au NPs與細胞相互作用

選取5種來源于不同組織的細胞（THP1、HeLa、MCF7、Hep G2和A549），與G13X共培養，考察細胞種類和G13X表面電荷對G13X與細胞相互作用的影響。這5種細胞中， THP1具有免疫細胞的某些特征，Hep G2和A549具備代謝器官（肝、肺）細胞的主要特征，MCF7為腺細胞，HeLa和A549具有上皮細胞的特征。在100

SymbolmA@ g/mL G13X存在時，所考察的細胞均能保持

Symbol～@@ 95%的存活率，說明G13X具有較低的細胞毒性。如圖2所示，當與100 μg/mL G13X共培養后，ICPMS分析結果表明，細胞對G13X的吞噬量與G13X的表面電荷以及細胞的種類有關。 5種細胞對G13X的吞噬量遵循G13C

Symbol～@@ G13N

Symbol～@@ G13A的規律， 不同細胞對同種G13X的吞噬量存在顯著差異，即免疫細胞（THP1）對G13X的吞噬能力遠大于體細胞，代謝能力強的細胞對G13X的吞噬能力也較強。這些實驗結果與文獻＼[12，13，26，27＼]的相關研究結果一致。細胞表面存在大量可與正電荷的G13C相互作用的電負性物質，這種靜電吸引力能夠增強G13C的跨膜能力，從而增大細胞對G13C的吞噬量。另外，在無FBS的培養基中，細胞處于饑餓狀態，代謝能力強的細胞對細胞外物質的吞噬能力也較強。

3.3Au NPs的生物相容性

將G13X分別通過尾靜脈注射到小鼠體內，在注射后第1、7和30天進行小鼠器官指數（器官重量除以小鼠體重）、血常規和免疫組化分析。如圖3所示，在所考察的時間內，小鼠器官指數的變異系數（Coefficient of variation，CV）值小于8%，此結果表明，G13X對小鼠器官指數沒有顯著影響。與對照組相比，實驗組小鼠的組織切片未表現出顯著的毒性和副作用（圖4）。血常規分析發現，實驗組小鼠的白細胞（White blood cell，WBC）相對于對照組（正常飼養）小鼠的WBC均顯著升高（表2）。在

注射G13X后第1天，小鼠的WBC升高了3倍以上； 在注射G13X后第1天，小鼠的WBC升高了3倍以上； 在注射G13X后第30天，小鼠的WBC仍是正常飼養的小鼠WBC的1.4倍以上。另外，注射G13C小鼠的WBC值大于注射G13N和G13A小鼠的WBC值。這些實驗結果表明，盡管G13X未表現出明顯的生物毒性，但能夠引起小鼠免疫系統的強烈響應，并與G13X與細胞作用能力存在正相關性，即G13C

Symbol～@@ G13N

Symbol～@@ G13A。這種強烈的免疫響應有可能誘發某些重大疾病（如器官炎癥等）。因此，在研發納米藥物時，必須考慮納米材料對生命體系的長期影響。

3.4Au NPs在小鼠體內的分布

使用ICPMS對尾靜脈注射G13X的小鼠體內主要器官（心、肝、脾、肺、腎、腦和骨髓）的金元素的含量進行了測定以獲得G13X在各個器官的分布。在注射后1天，G13X廣泛分布于小鼠的各個器官，其中肝和脾對G13X富集量較大（圖5A）。在注射7天后，肝和脾中G13X的量顯著增加并表現出表面電荷依賴性（富集量G13A>G13N>G13C），但其它器官中G13X的量減少（圖5B）。隨著時間的延長，小鼠肝和脾中G13X的量逐漸減少（圖5C）。上述實驗結果表明，G13X可以在不同器官之間易位，最終在肝和脾中富集， 并可能由肝代謝緩慢排出體外。在注射30天后，G13X仍大量富集于肝和脾中，說明G13X能夠長期滯留在動物體內（圖5C），這種長期滯留與血液中WBC升高具有一致性（見表3）。由于細胞對G13A的吞噬速度遠小于G13C和G13N（圖2），因此G13A在體內清除較慢。另外，小鼠血液中G13X隨時間的增加而逐漸降低，但在30天后血液中仍存有痕量G13X， 這也說明Au NPs能夠通過血液循環由其它器官逐漸轉移到肝脾中，并被排出體外。這種緩慢的代謝過程增加了G13X的生物毒性風險。

為了進一步考察Au NP是否在體內發生分解，在注射G13C 30天后對小鼠的肝、脾組織進行了TEM表征。如圖6所示，在肝組織的上皮細胞和巨噬細胞以及脾組織的淋巴細胞中發現大量的G13C，其粒徑沒有發生顯著減小。此結果表明Au NP在活體體內具有良好的膠體穩定性，能夠被上皮細胞和淋巴細胞長期儲存，并逐漸被肝臟的巨噬細胞緩慢清除體外。

4結 論

考察了表面電荷對PEG修飾的13 nm Au NPs與細胞相互作用以及在活體體內分布的影響。結果表明， PEG修飾的Au NPs具有較低的生物毒性， Au NPs的表面電荷決定細胞對AuNPs的吞噬量和AuNPs在體內器官的富集量， Au NPs能夠通過血液循環在體內發生器官易位，最后富集于肝和脾中并通過肝代謝緩慢排出體外， 細胞對Au NPs的吞噬速度能夠影響其在體內的代謝速度， Au NPs在體內能夠長時間的保持形貌并能夠引起動物的免疫響應。Au NPs在代謝器官中的長期滯留，提示在使用貴金屬類納米藥物時必須考慮其對活體細胞及器官功能的長期和潛在的影響。

References

1LizMarzan L M. Mater. Today， 2004， 7（2）： 26-31

2Murphy C J， Gole A M， Stone J W， Sisco P N， Alkilany A M， Goldsmith E C， Baxter S C. Acc. Chem. Res.， 2008， 41（12）： 1721-1730

3Caruso F， Hyeon T， Rotello V M. Chem. Soc. Rev.， 2012， 41（7）： 2537-2538

4Shi Z Z， Ren W Z， Gong A， Zhao X M， Zou Y H， Brown E M B， Chen X Y， Wu A G. Biomaterials， 2014， 35（25）： 7058-7067

5Xia Y Z， Wu X X， Zhao J T， Zhao J S， Li Z， Ren W Z， Li A G， Shen Z Y， Wu A G. Nanoscale， 2016， 8（44）： 18682-18692

6Du C L， Wang A L， Fei J B， Zhao J， Li J B. J. Mater. Chem. B， 2015， 3（22）： 4539-4545

7Deng J J， Yu P， Wang Y X， Yang L F， Mao L Q. Adv. Mater.， 2014， 26（40）： 6933-6943

8AyalaOrozco C， Urban C， Knight M W， Urban A S， Neumann O， Bishnoi S W， Mukherjee S， Goodman A M， Charron H， Mitchell T， Shea M， Roy R， Nanda S， Schiff R， Halas N J， Joshi A. ACS Nano， 2014， 8（6）： 6372-6381

9Khlebtsov N， Dykman L. Chem. Soc. Rev.， 2011， 40（3）： 1647-1671

10Joris F， Manshian B B， Peynshaert K， De Smedt S C， Braeckmans K， Soenen S J. Chem. Soc. Rev.， 2013， 42（21）： 8339-8359

11Fratoddi I， Venditti I， Cametti C， Russo M V. Toxicol. Res.， 2015， 4（4）： 796-800

12Jiang W， Kim B Y S， Rutka J T， Chan W C W. Nat. Nanotechnol.， 2008， 3（3）： 145-150

13Liu X S， Huang N， Li H， Jin Q， Ji J. Langmuir， 2013， 29（29）： 9138-9148

14Deol S， Weerasuriya N， Shon Y S. J. Mater. Chem. B， 2015， 3（29）： 6071-6080

15Goodman C M， Mccusker C D， Yilmaz T， Rotello V M. Bioconjugate Chem.， 2004， 15 （4）： 897-900

16Schaeublin N M， Braydichstolle L K， Schrand A M， MillerJ M， Hutchison J， Schlager J J， Hussain S M. Nanoscale， 2011， 3（2）： 410-420

17Vetten M A， Tlotleng N， Rascher D T， Skepu A， Keter F K， Boodhia K， Koekemoer L A， Andraos C， Tshikhudo R， Gulumian M

. Particle Fibre Toxicol.， 2013， 10： 50

18Yang H， Du L B， Tian X， Fan Z L， Sun C J， Liu Y， Keelan J A， Nie G J. Toxicol. Lett.， 2014， 230（1）： 10-18

19Fraga S， Brando A， Soares M E，Morais T， Duarte J A， Pereira L， Soares L， Neves C， Pereira E， Bastos Mde L， Carmo H. Nanomed. Nanotechnol. Biol. Med.， 2014， 10（8）： 1757-1766

20De Jong W H， Hagens W I， Krystek P， Burger M C， Sips A J， Geertsma R E. Biomaterials， 2008， 29， 1912-1919

21Chen J， Wang H， Long W， Shen X， Wu D， Song S S， Sun Y M， Liu P X， Fan S， Fan F Y， Zhang X D， Inter. J. Nanomed.， 2013， 8， 2409-2419

22Turkevich J， Stevenson P C， Hillier J. Faraday Soc.， 1951， 11： 55-75

23Frens G. Nature， 1973， 241（105）， 20-22

24Cui M H， Liu R X， Deng Z Y， Ge G L， Liu Y， Xie L M. Nano Res.， 2014， 7（3）： 345-352

25Corbo C， Molinaro R， Parodi A， Furman N E T， Salvatore F， Tasciotti E. Nanomedicine （Lond.）， 2016， 11（1）： 81-100

26Pillai P P， Huda S， Kowalczyk B， Grzybowski B A. J. Am. Chem. Soc.， 2013， 135（17）： 6392-6395

27Hühn D， Kantner K， Geidel C， Brandholt S， De Cock I， Soenen S J H， Gil P R， Montenegro J M， Braeckmans K， Müllen K， Nienhaus G U， Klapper M， Parak W J. ACS Nano， 2013， 7（4）： 3253-3263