丹皮酚與鈣粘素相互作用的分析研究

許鳳杰++彪林海++祖元剛++劉志國

摘要丹皮酚對多種腫瘤細胞具有抑制作用，而鈣粘素是與腫瘤產生和惡化密切相關的一類糖蛋白。本研究運用熒光光譜法和原子力顯微技術探索了丹皮酚與鈣粘素的相互作用。熒光光譜法研究結果表明，丹皮酚對鈣粘素的熒光具有顯著的猝滅作用，通過猝滅常數隨溫度變化趨勢推斷為靜態猝滅過程。丹皮酚與鈣粘素形成復合物的熱力學參數分別為ΔH=

Symbolm@@ 4.3×105 J/mol和ΔS=-1.3×103 J/（mol·K）， 表明此結合過程以氫鍵和范德華力為主。原子力顯微觀察結果表明，鈣粘素分子間可形成有序長鏈結構，丹皮酚加入后能顯著破壞這種組裝結構而形成短鏈結構，這是由于丹皮酚與鈣粘素末端色氨酸殘基的作用而影響相鄰鈣粘素分子結構域間的交錯作用所致。本研究結果表明，鈣粘素可能是丹皮酚體現其活性的一個重要作用靶點。

關鍵詞丹皮酚； 鈣粘素； 熒光光譜法； 原子力顯微鏡

1引 言

丹皮酚（Paeonol）是在傳統中藥牡丹皮中提取出的一種小分子酚類化合物。近來的研究發現丹皮酚具有抗腫瘤作用＼[1＼]。藥理活性實驗顯示，丹皮酚對食道癌、胃癌、肝癌、結腸癌等多種癌細胞具有明顯的抑制作用＼[2～4＼]。深入探索丹皮酚在體內的各種可能的作用靶點及它們之間的作用機制，可為進一步開發丹皮酚及其衍生物作為抗癌藥物提供科學依據。

中藥小分子可與人體內的蛋白發生相互作用，從而決定其藥理活性作用＼[5＼]。研究發現，丹皮酚和阿魏酸在生理條件下均能與人血清白蛋白（HSA）發生相互作用，并且它們之間會競爭HSA上的同一位點。因此，中醫用藥常將含有丹皮酚與阿魏酸的中藥配伍使用來提高療效。丹皮酚在體內還可能與其它蛋白產生相互作用，進而影響其藥理活性。

鈣粘素（Cadherin）是在細胞與細胞粘附過程中發揮重要作用的一類鈣離子依賴型粘附蛋白＼[6＼]。Pary ＼[7＼]和AnneKarina ＼[8＼]等的研究都證實了E鈣粘素與癌癥的發生和發展有重要聯系。最近的研究表明，血清中E鈣粘素的濃度增高與腫瘤發生及侵襲轉移密切相關＼[9～12＼]。胃腸癌患者血清中可溶性鈣粘素的濃度顯著高于健康對照組，這可能是由于腫瘤細胞表面的E鈣粘蛋白降解并釋放到血液中的緣故。因而，血清中可溶性鈣粘素的濃度可作為預防、診斷和治療胃腸癌的一個重要指標＼[10，11＼]。

丹皮酚在血液中可與人血清白蛋白發生相互作用。最近的研究證實了丹皮酚可與人血清白蛋白以疏水作用形成復合物＼[13＼]。胃癌患者血清中可溶性鈣粘素的濃度平均水平（9344 ng/mL）顯著高于健康對照組（5616 ng/mL），并與腫瘤大小呈正相關＼[11＼]。因而，在胃癌患者的血清中，丹皮酚將有更多的機會與鈣粘素發生相互作用。本研究采用熒光光譜法和原子力顯微技術，分析了丹皮酚與鈣粘素的相互作用過程。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

F7000熒光光譜儀（日本日立公司）； NanoPhotometer N60型超微量分光光度計（德國IMPLEN公司）； PicoplusⅡ型原子力顯微鏡系統（美國Molecular Imaging公司）。

丹皮酚（純度≥99%， 上海阿拉丁生化科技股份有限公司）； 鈣粘素（ECadherin human， recombinant純度≥90%）和人血清白蛋白（HSA）， 購自于西格瑪奧德里奇（上海）有限公司； 鈣粘素原始濃度為0.5 mg/mL。 高定向熱解石墨片（HOPG， 愛沙尼亞Mikro Masch公司）。實驗用水由MilliQ系統（電阻率>18 MΩ cm）純化制得。

2.2實驗方法

2.2.1熒光光譜測定使用甲醇溶解丹皮酚，配制1 mmol/L溶液，然后用超純水逐步稀釋該溶液， 制得1 μmol/L丹皮酚溶液。用磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH 7.4）稀釋鈣粘素原始溶液，配制0.2 μmol/L鈣粘素溶液，用于光譜測定。在室溫和37℃條件下，依次向0.2 μmol/L鈣粘素溶液中滴入不同體積1 μmol/L

丹皮酚溶液，混合液在恒溫水浴保持5 min后，以280 nm為激發波長，在290～500 nm范圍內記錄熒光光譜圖。

2.2.2原子力顯微鏡（AFM）觀察樣品的制備和表征采用磷酸鹽緩沖液將不同溫度條件下0.2 μmol/L鈣粘素與1 μmol/L丹皮酚相互作用的溶液，稀釋10倍，用于制作原子力顯微鏡觀察樣品。采用磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH=7.4）稀釋鈣粘素原始溶液，配制0.02 μmol/L溶液，用于觀察單獨鈣粘素結構。制作原子力顯微鏡觀察樣品時，分別取50 μL待觀察溶液，滴加于新制備的高定向熱解石墨片（HOPG）上，靜置吸附10 min后，除去液滴，用超純水沖洗10次以上，用以去除吸附不牢固的蛋白，最后用氬氣吹干。在使用原子力顯微鏡觀察前，將樣品放在干燥器中保存。

在氣相室溫條件下，原子力顯微鏡采用輕敲模式進行成像。成像時使用NSC35探針（Mikromasch），針尖曲率半徑<10 nm，力常數7.5 N/m，掃描速度<1 lines/s，成像的共振頻率為130 kHz，所得原子力顯微圖像分辨率均為512 × 512。

3結果與討論

3.1丹皮酚與鈣粘素相互作用的紫外光譜法和熒光光譜法研究

圖1A為丹皮酚、鈣粘素以及兩者相互作用后溶液的紫外光譜吸收圖。丹皮酚在275和312 nm處有較強的吸收峰，此結果與文獻＼[14＼]一致。鈣粘素在280 nm有較強吸收峰。兩者相互作用后，溶液的紫外吸收圖譜與丹皮酚的圖譜極為相似，由于吸收圖譜相互疊加，所以吸收強度略有增高。

在紫外吸收測定的基礎上，進一步在室溫和37 ℃條件下分別測定了丹皮酚對鈣粘素熒光光譜的影響。鈣粘素在280 nm激發后， 在337 nm處出現最大熒光發射峰見圖1B中a曲線，而丹皮酚在此波段沒有明顯的熒光。逐漸加入丹皮酚， 最大熒光發射峰的強度逐步下降，如圖1B中b～k所示。此外，鈣粘素最大熒光發射波長從337 nm藍移至了335 nm。發射波長的藍移表明鈣粘素分子中色氨酸殘基的周圍環境發生了變化。加入丹皮酚可能使色氨酸殘基的吲哚基團重新排列至一個更加疏水的微環境＼[15＼]。熒光猝滅數據可由SternVolmer方程進行分析＼[16＼]：

式中， F0和F分別為無猝滅劑和有猝滅劑時鈣粘素的熒光強度， ＼[Q＼]為猝滅劑的濃度， KSV為猝滅常數， Kq是猝滅速率常數。 τ0為沒有猝滅劑存在下熒光分子平均壽命， 生物大分子熒光壽命約為10

Symbolm@@ 8 s。

在不同溫度條件下計算得到的猝滅常數KSV見表1， KSV隨溫度升高而降低， 表明丹皮酚對鈣粘素的猝滅可能是靜態猝滅＼[16＼]。另外，由KSV可粗略推算出Kq值，遠大于猝滅劑對生物大分子的最大動態猝滅速率常數2.0 ×1010 L/（mol·s）＼[16＼]，進一步表明丹皮酚與鈣粘素的作用屬于靜態猝滅， 它們之間可形成了復合物。

丹皮酚與鈣粘素的結合常數（Kb）及結合位點數（n）可由靜態猝滅方程進行分析＼[17＼]。

式中， F0和F分別是鈣粘素與丹皮酚結合前和結合后的熒光強度。lg（（F0-F）/F）對lg＼[Q＼]作圖， 所得直線的斜率為n， 與Y軸截距為lgK。不同溫度時所得的K和n值列于表1。由表1可知， K值隨溫度升高而顯著減小， 表明鈣粘素與丹皮酚復合物的穩定性逐漸減弱。室溫時n≈1，表明丹皮酚在鈣粘素上有一個結合位點。

Concentration of paeonol （a-k） is 0， 0.0024， 0.0048， 0.0072， 0.0096， 0.012，0.014， 0.016， 0.019， 0.021 and 0.023 μmol/L， respectively. T=298 K.

在相同條件下，考察了丹皮酚與人血清白蛋白的相互作用。丹皮酚對人血清白蛋白的熒光猝滅圖見圖1C。通過對猝滅常數的計算推測丹皮酚對人血清白蛋白猝滅也為靜態猝滅.計算所得猝滅常數（Ksv）、結合常數（K）及結合位點數（n）數值見表1。結果表明，丹皮酚也可與人血清白蛋白形成復合物。由表1的結合常數值可知，在室溫和37℃度條件下，丹皮酚與鈣粘素的結合常數值均大于它與人血清白蛋白的值，這表明丹皮酚與鈣粘素具有更強的相互作用。

3.2丹皮酚與鈣粘素結合反應的熱力學函數

當體系中溫度變化較小時，結合反應的焓變ΔH可認為是常數。熱力學參數焓變ΔH、熵變ΔS及自由能變化ΔG可由Van′t Hoff 方程及自由能公式確定，計算所得ΔH、ΔS和ΔG值列于表 1。

ΔG<0，表明丹皮酚與鈣粘素的結合是自發進行的。ΔH<0，表明形成復合物的過程是放熱過程。小分子與蛋白相互作用的熱力學函數可用于判斷它們之間作用力的類型。依據Ross 等關于小分子與蛋白結合過程中熱力學數據與各種作用力的關系研究＼[18＼]，ΔH<0和ΔS<0， 表明結合過程以氫鍵和范德華力為主。

丹皮酚與人血清白蛋白結合的熱力學函數也列入了表1中，依據ΔG、ΔH、ΔS值的大小，可推斷丹皮酚與人血清白蛋白的結合也是自發進行的。丹皮酚與鈣粘素的結合過程中ΔH值遠大于它與人血清白蛋白的ΔH，說明丹皮酚與鈣粘素能形成更穩定的復合物。Wang＼[13＼]研究表明，丹皮酚與人血清白蛋白主要通過疏水相互作用，形成復合物，導致人血清白蛋白的二級結構和三級結構都發生改變。本研究表明丹皮酚與鈣粘素的作用以氫鍵和范德華力為主。所以，丹皮酚與人血清白蛋白和鈣粘素的作用方式不同，使得它與兩種蛋白的結合能力有差別。

3.3原子力顯微鏡（AFM）成像結果分析

運用原子力顯微鏡可在單分子水平上研究蛋白及其組裝結構＼[19，20＼]。圖2為鈣粘素與丹皮酚作用前后典型的原子力顯微鏡成像。在圖2A中，未與丹皮酚作用的鈣粘素呈現為連續長度約500 nm的長鏈結構及交叉鏈狀結構。與丹皮酚作用后，鈣粘素分子間形成的鏈狀結構的長度明顯減小（圖2B）。此外，作用溫度對于鈣粘素的結構也有顯著影響。 如圖2（B～D）所示。隨著作用溫度逐漸升高，鈣粘素分子間形成的長鏈結構逐步減少。

圖2A 中原子力顯微鏡觀察到的長鏈結構以及交叉鏈狀結構的形成與鈣粘素單體的特異結構有關。晶體結構研究結果表明， 鈣粘素單體由5個重復的結構域首尾相連而成（EC domain 1～5）＼[21＼]。每個結構域為一個圓筒狀結構，其三維尺寸為4.5 nm ×2.5 nm × 2.5 nm。由于每兩個結構域連接時存在一個微小的彎曲，致使整個鈣粘素單體呈現香腸狀，其首尾間的長度約為20.7 nm＼[6＼]。高靈敏力譜實驗證實了鈣粘素結構域間存在著交錯作用，如EC1結構域與另一個分子其它結構域的作用＼[6＼]。這種鈣粘素分子結構域間的交錯作用可能是形成長達幾百納米長鏈結構的根本原因。另外，兩個鈣粘素分子間還能產生EC1結構域間相互作用。每個鈣粘素單體的N端（EC1結構域）遠側的色氨酸殘基能進入另一個單體的疏水腔，進行鏈交換作用，形成穩定的二聚體結構＼[21，22＼]。此外，高分辨電鏡研究結果表明，鈣粘素分子間還能產生更復雜的作用，如3個鈣粘素分子間能形成交叉結構，4個分子間能產生四鏈結構＼[23＼]，這可能是形成圖2A中交叉長鏈狀結構的基礎。

在圖2B中，當鈣粘素與丹皮酚作用后，鏈狀結構的長度顯著減小，主要是由于丹皮酚與鈣粘素分子的N端（EC1結構域）色氨酸殘基產生作用，這種作用已被上述熒光猝滅結果所證實，作用后可能影響了鈣粘素EC1結構域與其它鈣粘素分子結構域間的交錯作用，因而不利于形成長鏈結構。隨著作用溫度升高至304和310 K，如圖2C和2D所示，鏈狀結構進一步減少，可能是因為較高的溫度更不利于鈣粘素EC1結構域與其它鈣粘素分子結構域間的交錯作用。

圖2D中箭頭所示分子的測量平均長度約為50 nm，平均高度為1.8 nm。晶體結構研究結果表明， 鈣粘素二聚體長度約為40 nm，直徑為2.5 nm＼[6＼]。考慮到原子力顯微鏡成像蛋白時的針尖加寬效應，此測定值與晶體結構得出的鈣粘素二聚體結果較為接近。因此根據原子力顯微成像中的形貌結構和幾何尺寸判斷， 存在鈣粘素的二聚體。鈣粘素分子間形成二聚體是由于兩個鈣粘素分子間N端EC1結構域色氨酸殘基的鏈交換作用所致。

本研究中所有原子力顯微鏡成像都均是在氣相條件下獲得的。蛋白樣品在制樣過程中會受到脫水和干燥過程的影響。此外，選用不同的觀察基底可能會影響觀察結果。分別考察了云母和HOPG為基底成像鈣粘素的效果，結果表明，鈣粘素在HOPG表面吸附和成像時重現性更好。另外，在HOPG 表面觀察到的鈣粘素的結構數據與其晶體結構數據也更相符。

4結 論

采用熒光光譜法和原子力顯微技術分析了丹皮酚與鈣粘素的相互作用。熒光光譜法研究結果表明，丹皮酚對鈣粘素的熒光具有顯著的猝滅作用，通過猝滅常數的計算及其隨溫度變化趨勢推斷這是一個靜態猝滅過程。在不同溫度條件下，丹皮酚與鈣粘素的結合常數均大于其與人血清白蛋白的結合常數值，這表明丹皮酚與鈣粘素具有更強的相互作用。丹皮酚與鈣粘素作用過程的熵、焓和自由能值表明它們之間的結合是以氫鍵和范德華力為主的自發進行的過程。高分辨原子力顯微觀察顯示， 與丹皮酚作用后， 鈣粘素分子間形成的鏈狀結構的長度明顯減小，并隨著溫度的升高愈加顯著。在310 K觀察到了鈣粘素分子間形成的二聚體結構。本研究結果表明，鈣粘素可能是丹皮酚體現其活性的一個重要的作用靶點。

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