基于遺傳多樣性分析的海洋保護區典型物種保護措施研究
——以山東昌邑國家級海洋生態特別保護區檉柳為例

劉國寧，雋云昌，張守本，李秋霞，秦華偉，宋秀凱，馬元慶，付新華

(1.濰坊市海洋環境監測中心站 濰坊 261041；2.山東省海洋環境與資源研究院 煙臺 264006；3.濰坊醫學院 濰坊 261053)

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基于遺傳多樣性分析的海洋保護區典型物種保護措施研究
——以山東昌邑國家級海洋生態特別保護區檉柳為例

劉國寧1，雋云昌1，張守本1，李秋霞1，秦華偉2，宋秀凱2，馬元慶2，付新華3

(1.濰坊市海洋環境監測中心站 濰坊 261041；2.山東省海洋環境與資源研究院 煙臺 264006；3.濰坊醫學院 濰坊 261053)

遺傳多樣性是評價自然生物資源的重要依據,可為遺傳資源保存、育種、遺傳改良以及制定物種保護措施等工作提供理論支撐。山東昌邑國家級海洋生態特別保護區是全國唯一的、以檉柳林生態系統為主要保護和管理對象的國家級海洋特別保護區。文章利用ISSR分子標記技術,對30個檉柳個體的遺傳多樣性進行分析,并根據分析結果提出避免從外區域移栽、控制人類活動和開展遺傳多樣性研究等保護措施,為深入了解該保護區典型保護物種檉柳的遺傳結構、多樣性、種質資源以及制定合理有效的生態系統保護策略提供理論依據。

遺傳多樣性;海洋保護區;檉柳;生態保護；ISSR分子標記

1 引言

生物多樣性包括遺傳多樣性、物種多樣性和生態系統多樣性3個層次，其中遺傳多樣性是物種多樣性和生態系統多樣性的基礎，更是評價自然生物資源的重要依據。對于遺傳多樣性的研究有助于更清楚地認識現有生物資源狀況,為采取更為適當的策略保護和合理利用現有資源提供正確的理論指導[1]，從而可為遺傳資源保存、育種、遺傳改良以及制定物種保護措施等工作提供理論依據[2-4]。隨著分子生物學技術的飛速發展，AFLP、SSR、ISSR和SNP等分子標記在遺傳多樣性研究中被經常使用[5-7]。其中，簡單重復序列間擴增(ISSR)不僅操作簡便、成本低，而且具有較好的穩定性和多態性，得以廣泛應用[8-10]。

檉柳(Tamarixchinensis)為檉柳科、檉柳屬[11]，因具有較高的耐鹽堿、耐水濕、抗風蝕沙埋等多種生物學特性，現已成為鹽堿地土壤改良中非常重要的樹種[12]。

山東昌邑國家級海洋生態特別保護區地處渤海萊州灣南岸，總面積2 929 hm2，是全國唯一的以檉柳林生態系統為主要保護和管理對象的國家級海洋特別保護區。該保護區內天然檉柳林面積大、分布集中、生態景觀奇特、地理位置特殊，在我國北方沿海實屬罕見。作為檉柳的自然基因寶庫，該保護區的檉柳居群在該區域自身生態系統維護與資源種質保護上均具有重要價值。

文章利用ISSR(Inter-Simple Sequence Repeat)分子標記技術，對30個檉柳個體的遺傳多樣性進行分析，并根據分析結果提出相應保護措施，為深入了解山東昌邑國家級海洋生態特別保護區典型保護物種檉柳的遺傳結構、多樣性、種質資源以及制定合理有效的生態系統保護策略提供理論依據。

2 材料與方法

在山東昌邑國家級海洋生態特別保護區內均勻布設30個站位。以采集檉柳葉為主，質量在50 g以上，放入雙層聚乙烯袋中，帶回實驗室冰凍保存(-10℃～-20℃)。

將檉柳葉剪碎、液氮研磨，采用Omega公司的植物組織DNA提取試劑盒提取檉柳基因組，利用GoldviewⅠ作核酸染料的1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，其中以1×TBE作為緩沖液，以87 V的電壓電泳30 min后，凝膠成像系統分析DNA提取結果，符合實驗需求的DNA提取物放于-20℃冰凍保存待用。

3 遺傳多樣性的ISSR分析

3.1 ISSR-PCR引物篩選

在哥倫比亞大學公布的100條引物中選取52條引物合成，隨機選取2個樣本為模板進行ISSR-PCR反應，PCR反應體系和條件參考文獻[13]。進行優化后，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結果，凝膠成像系統分析以篩選用于分析的適當引物。適當引物其擴增產物應條帶清晰，且對所有樣本均有質量好的多態性條帶。

3.2 ISSR-PCR擴增

分別以30個檉柳樣本提取好的基因組DNA為模板,以篩選后的ISSR引物進行PCR擴增。其PCR反應體系(20 μL)及條件經條件優化后為：1 μLDNA模板、1 μL引物、10 μL DreamTap Green PCR Master Mix(2×)、8 μLddH2O。PCR反應程序為：95℃，5 min預變性；95℃、30 s變性,50℃、30 s退火，72℃、45 s延伸的35個循環；72℃，10 min延伸；4℃結束。PCR產物再經過瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像系統拍照,以待統計分析。

3.3 結果統計與數據分析

根據瓊脂糖凝膠電泳圖譜，人工直接判讀每個個體的等位基因,擴增條帶用“1”和“0”表示有或無，建立數據庫。利用Popgene 1.32軟件計算群體內相關遺傳系數[14]，主要包括遺傳多樣性系數(觀測等位基因數、有效等位基因數、Nei’s基因多樣性指數、Shannon’s表型多樣性指數)和多態性位點百分比。

根據核苷酸條帶將數據錄入Popgene 1.32中，作為二倍體數據進行處理，計算群體內相關遺傳系數，主要包括遺傳多樣性系數(觀測等位基因數、有效等位基因數、Nei’s基因多樣性指數、Shannon’s表型多樣性指數)、多態性位點百分比和Ewens-Watterson中性檢驗(即根據等位基因變異頻率的偏倚檢測群體是否偏離中性進化)。

采用NTSYSpc-2.10對編輯好的數據進行處理，計算所有個體之間的遺傳距離矩陣、遺傳相似性并繪制聚類圖[15]。

根據NTSYSpc-2.10計算的遺傳距離矩陣，將該矩陣轉換為.meg格式，再使用MEGA 6.06進行處理，計算該群體內的平均遺傳距離并繪制系統發育樹。

4 結果與分析

4.1 引物篩選

從哥倫比亞大學公布的100條引物中篩選出利于分析的12條引物，以進行ISSR-PCR體系擴增分析(表1)。

表1 用于基因組DNA序列ISSR-PCR反應的引物序列

續表

4.2 ISSR-PCR反應結果

篩選出來的12條引物分別PCR擴增30個樣本，經電泳檢測可見每個DNA模板下對應一至多個條帶，且條帶的亮度呈現差異性(圖1)。

圖1 檉柳引物ISSR擴增

在瓊脂糖凝膠電泳圖譜中，各模板對應一至多個條帶。在同一模板中，條帶的位置不同體現擴增出的DNA長度的差異，條帶的條數不同體現基因組模板具有多個結合位點；在不同模板中，存在條帶條數、位置、圖上帶亮度等的差異，體現各樣本與引物結合位點、結合力等的差異，即表現檉柳各樣本的遺傳多樣性。

4.3 ISSR多樣性系數

山東昌邑國家級海洋生態特別保護區的30個檉柳樣本，觀測等位基因數(Na)為1.810 8、有效等位基因數(Ne)為1.310 1、Nei’s基因多樣性指數(He)為 0.194 8、Shannon’s表型多樣性指數(I)為0.313 8、多態性位點百分比(PPB)為81.08%、平均遺傳距離為0.182 043 93，檉柳的系統發育樹如圖2所示。結果表明，檉柳的遺傳多樣性較高、個體間的遺傳距離較大。

圖2 檉柳聚類

5 結論與建議

山東昌邑國家級海洋生態特別保護區內的檉柳具有相對豐富的遺傳多樣性，Shannon’s表型多樣性指數(I)為0.313 8、多態性位點百分比(PPB)為81.08%。檉柳具有多年生習性和復雜交配體系，兼性異交，但缺乏自花傳粉機制，只能通過蠅和蜜蜂等傳粉媒介授粉[16]，其個體間的異交機會隨之增加，因而提高該物種遺傳多樣性的豐度，這可能是保護區內檉柳遺傳多樣性穩定的主要原因。建議繼續加大對檉柳保護區的保護力度，避免從外區域移栽，保護檉柳的分布范圍和數量，防止遺傳多樣性指數降低。

山東昌邑國家級海洋生態特別保護區內人口密度小，人為活動對檉柳居群遺傳多樣性的影響較小，此外保護區對檉柳資源的保護力度較大，從而使該區檉柳遺傳多樣性得以維持較高水平。建議繼續控制人類在保護區內的活動，避免過度開發，保持遺傳多樣性的穩定。

山東昌邑國家級海洋生態特別保護區內檉柳的遺傳多樣性指數比黃河三角洲小[13]，其原因可能是黃河三角洲檉柳居群研究樣品量較大，而居群變小會導致遺傳多樣性指數降低[17]。建議擴大保護區檉柳樣本量，繼續開展檉柳遺傳多樣性研究，在遺傳多樣性分析的基礎上盡快制定保護區發展規劃，合理移栽區內檉柳，加大檉柳居群，提高檉柳遺傳多樣性指數，將保護區建成管理先進、體系完善、機制創新、功能齊全的海洋生態特別保護區。

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Protection Measures for Typical Species in Marine Protected Areas Based on the Analysis of Genetic Diversity:TakeTamarixchinensisin Shandong Nearby National Special Marine Reserve as an Example

LIU Guoning1，JUAN Yunchang1，ZHANG Shouben1，LI Qiuxia1，QIN Huawei2，SONG Xiukai2，MA Yuanqing2，FU Xinhua3

(1.Weifang Marine Environment Monitoring Centre，Weifang 261041，China;2.Shandong Marine Resource and Enviroment Research Institute，Yantai 264006，China;3.Weifang Medical University，Weifang 261053，China)

Genetic diversity is the important basis for evaluation of natural biological resources，which can provide theory support for conservation,breeding and genetic improvement of genetic resources,as well as making protection measures to protected species.Shandong nearby national marine ecological special reserve is the only national marine protected areas taking tamarix as the main object of protection and management.The genetic diversity of 30 tamarix samples were analyzed by using ISSR molecular markers,to understand the genetic structure,diversity,germplasm resources and corresponding protection measures of avoiding transplanting from outside areas,controling human activities and carrying out genetic diversity research,according to the results.It also will provide theoretical basis to formulate rational and effective ecosystem protection strategies.

Genetic diversity，Marine protected areas，Tamarixchinensis，Ecological protection,ISSR molecular markers

2016-12-19；

2017-05-22

山東省渤海海洋生態修復及能力建設項目(20140601)；濰坊市科學發展計劃項目(2016ZJ1047).

劉國寧，工程師，研究方向為海洋環境監測，電子信箱：hjk@wfhy.ac.cn

付新華，副教授，博士，研究方向為生物化學與分子生物學，電子信箱：wfyxyfxh@163.com

P74

A

1005-9857(2017)06-0046-05