櫻花新品種白玉吉野組培快繁技術研究

羅桂杰，金 倩，陳 芬

(江蘇省農業科學院 宿遷農科所，江蘇 宿遷 223800)

櫻花新品種白玉吉野組培快繁技術研究

羅桂杰，金 倩，陳 芬

(江蘇省農業科學院 宿遷農科所，江蘇 宿遷 223800)

以白玉吉野當年生帶腋芽莖段為外植體，進行了外植體的滅菌、啟動、增殖和生根培養試驗。試驗結果表明：外植體滅菌消毒方法為75%乙醇浸泡30 s，0.1% HgCl2浸泡6 min，成活率達51.33%；促進腋芽誘導最佳培養基配方：MS+2.0 mg/L BA+0.2 mg/L IBA，誘導率為72.65%；適宜的增殖最佳培養基配方：MS+2.5 mg/L BA+0.2 mg/L NAA，增殖系數為5.76；誘導生根率最高的培養基配方為MS+0.5 mg/L BA+0.2 mg/L NAA，生根率達92.02%。

白玉吉野;組培；快繁技術

櫻花(Cerasus)隸屬于薔薇科(Rosaceae)李亞科(Prunoidea)。全世界共150余種，主要分布于北半球溫帶地區，多數種類分布于中國、日本和朝鮮。該植物資源豐富，有著豐富野生資源和栽培種類[1-2]，中國的野生櫻花資源十分豐富，遠遠超過日本及相鄰國家，分布范圍很廣，從東北到西南，都有櫻花生長。目前，中國櫻屬植物超過50個種或變種，至今已發表中國櫻屬植物野生種(變種)雙學名293個，已處理272個，21個學名未處理，需進一步研究[3]。

隨著櫻花的廣泛應用，研究櫻花的快速繁殖技術顯得尤為重要，傳統的繁殖方法有播種、嫁接等繁殖技術。觀賞櫻花從1991年開始，中國科學院武漢植物研究所做了櫻花組織培養方面的研究，并且獲得了正常的組培苗[4]。王文房等在6-BA和NAA兩種激素配比誘導下，對櫻花花柄進行組織培養，得到了最適合櫻花花柄形成愈傷組織的激素濃度配比，結果表明：在MS培養基中加3.0～4.0 mg/L NAA和1.0～2.0 mg/L 6-BA最適合櫻花花柄形成愈傷組織[5]。白玉吉野原產于日本，其花色為純白色，目前我國多數景點應用中主要以粉色系櫻花品種為主，在園林中特別缺少白色花系的品種。因此近幾年我國從日本引進白玉吉野，由于這些品種量少價高，因而難以適應市場商品化生產的需求，嚴重限制了白玉吉野新品種的大面積推廣。組織培養方法繁殖具有繁殖周期短、全年都能進行繁殖、繁殖系數高等特點，筆者以白玉吉野為試材，系統研究了不同激素及不同濃度誘導白玉吉野愈傷及不定芽的發生，找到影響無菌苗生長發育的制約因子和最佳的使用濃度，使其快繁技術進一步系統化，為白玉吉野產業化發展提供切實可行的技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

白玉吉野采自宿豫區運河灣農科院櫻花園，白玉吉野當年生、健壯無病蟲害的嫩枝中上部位作為外植體，去掉葉片留葉柄。

1.2 培養條件

外植體的腋芽誘導、增殖培養和生根培養都在培養室內進行，基本培養基均加入30 g/L蔗糖、6.0 g/L瓊脂、pH 5.8，培養室溫度控制在25～26 ℃，日光燈光照強度1200 lx左右，光照時間為12 h/d。

1.3 方法

1.3.1 外植體前處理 用洗手刷蘸洗衣粉輕輕刷洗莖段表面及腋芽處，經自來水沖洗干凈，再切成2～3 cm的小段，每段至少有一個側芽，用自來水沖洗一遍。

1.3.2 外植體滅菌消毒 對植物材料進行前處理后，轉入超凈工作臺進行如下消毒處理:70%乙醇浸泡10 s，然后用0.1% HgCl2加吐溫2滴約0.01 mL浸泡，時間分別3、4、5、6、7、8 min，再用無菌水沖洗5遍。消毒后，將植物材料接種到培養基中，每瓶接1個。

1.3.3 腋芽誘導培養基的篩選 采用MS基本培養基，利用不同濃度的BA、IBA設計試驗，BA的濃度為1.0、1.5、2.0 mg/L，IBA的濃度為0.1、0.2、0.3 mg/L，共9個組合(表2),定期觀察有無污染情況，接種35 d后統計愈傷誘導及生長情況,找出腋芽誘導效果最佳的配方。

1.3.4 增殖培養基的篩選 采用MS基本培養基，利用不同濃度的BA、NAA設計試驗，BA的濃度為2.5、3.0、3.5 mg/L，NAA的濃度為0.1、0.2、0.3 mg/L共9個組合(表3)。選取生長一致、狀況良好、緊密，帶有綠色芽點的愈傷組織進行不定芽誘導與增殖試驗。35 d后統計分化率、增殖系數，找出最佳增殖培養基配方。

1.3.5 生根培養基的篩選 選擇2～3 cm高、生長健壯整齊一致的試管苗先在空白MS培養基上培養14 d左右，以消除前期激素對生根試驗的影響，然后進行生根培養，基本培養基采用MS，利用不同濃度的BA、NAA設計試驗，BA的濃度為0.5、1.0、1.5 mg/L，NAA的濃度為0.1、0.2、0.3 mg/L。35 d后統計無菌苗生根率、平均根數、平均根長。

2 結果與分析

2.1 外植體滅菌消毒

白玉吉野外植體在快繁中易污染而引起褐變，0.1% HgCl2合理的滅菌時間可達到較好的滅菌效果。滅菌時間過短，外植體的污染率過高，達不到滅菌的目的；滅菌時間過長會對外植體造成傷害，從而加重外植體的褐化，影響其成活率。

由表1可以看出，0.1% HgCl2消毒時間3 min時，滅菌不徹底，污染率高達100%，顯著高于其他各處理，隨著消毒時間增加，污染率逐漸降低；反之，褐化率隨著消毒時間的增加而呈正向相關，但是消毒時間過長大于6 min時，外置體成活率逐漸降低，褐化死亡率比較高。因此，在消毒時間為6 min時，成活率最高達51.33%，與其他各處理間差異顯著。由此看來，用0.1% HgCl2消毒6 min是比較理想的消毒方法。

表1 0.1% HgCl2不同消毒時間對 白玉吉野成活率的影響

注：LSD顯著性檢驗，不同字母表示在0.05水平下差異顯著。

2.2 腋芽誘導

表2中數據表明，在腋芽誘導的2種因素中，根據K值的大小，BA的作用最明顯，其次是IBA的影響。因此，兩者對腋芽誘導影響的主次關系為BA>IBA。

方差分析結果顯示(表3)，BA的3個水平在影響腋芽誘導方面差異極顯著，隨著BA濃度的升高，誘導率增加。其次是IBA的作用，對腋芽誘導有顯著影響。當IBA濃度為0.1 mg/L，腋芽愈傷組織出現較早，在接種12 d后出現愈傷，隨著BA濃度的增加，誘導率隨之增加，但愈傷生長狀況普遍較差，早期顏色偏白色、密度小，后期褐化比較嚴重，芽點少；當IBA濃度為0.3 mg/L時，隨著IBA濃度的增加，誘導率反而下降；IBA的濃度為0.2 mg/L時，隨著BA濃度的增加，誘導率隨之升高，當BA濃度為2.0 mg/L，誘導率雖然不是最高為72.65%，但愈傷組織生長狀況良好，緊密、淺綠色，隨著培養時間增加，有較多的小芽點。因此，促進腋芽愈傷組織分化的最佳培養基配方：MS+2.0 mg/L BA+0.2 mg/L IBA。

2.3 無菌苗增殖誘導

極差的大小反映了該因素對指標值影響的大小，極差大則該因素對指標值的影響大，極差小則該因素對指標值的影響小。為比較BA、NAA對不定芽誘導與增殖的影響，對這2個因素進行極差分析，極差分析結果表明，BA、NAA對增殖系數影響的主次關系為BA>NAA(表4)。

表2 不同激素濃度配比對腋芽誘導的影響

注：K1、K2、K3分別表示水平1、水平2、水平3的平均指標值，RC2表示增殖系數的極差。

表3 不同激素濃度配比對腋芽誘導影響的方差分析

方差分析結果顯示(表5)，BA的3個水平在影響組培苗增殖方面差異極顯著。隨著BA濃度的升高，增殖系數隨之下降，在BA濃度為2.5 mg/L時增殖系數和分化率都最高，對組培苗增殖培養的效果最佳。其次是NAA的作用，對組培苗增殖有顯著影響，隨著NAA濃度的增加，增殖系數先升高后降低，當NAA濃度為0.2 mg/L時增殖系數相對比較高。綜上分析，無菌苗增殖最佳培養基配方：MS+2.5 mg/L BA+0.2 mg/L NAA。

表4 不同激素對不定芽誘導與增殖的影響

注：K1、K2、K3分別表示水平1、水平2、水平3的平均指標值，RC2表示增殖系數的極差。

2.4 生根誘導

表6中數據表明，BA、NAA對生根誘導的影響順序是BA>NAA，這說明，影響生根效果的2個因素中BA的作用最明顯，其次是NAA。由K值的大小可以看出，生根率隨著BA濃度的增加而降低，而NAA對生根率的影響隨著濃度的增加先升高后降低，當NAA濃度為0.2 mg/L時，生根率最高。

表5 不同激素對不定芽誘導與增殖影響的方差分析

由表7方差分析結果說明，BA濃度為1.0、1.5、2.0 mg/L 3個水平之間差異極顯著。BA各濃度對組培苗生根的影響為0.5>1.5>2.0 mg/L，這說明0.5 mg/L BA是生根的最佳用量；NAA的濃度分別為0.1、0.2、0.3 mg/L時各濃度對生根影響的順序是0.2>0.1>0.3 mg/L。由方差分析結果說明(表7)，NAA的3個濃度在誘導組培苗生根方面差異極顯著，NAA濃度為0.2 mg/L時誘導組培苗生根率最高，當NAA濃度大于0.2 mg/L時，反而對組培苗的生根有一定程度的抑制作用。由此確定，誘導生根率最高的培養基配方為MS+0.5 mg/L BA+0.2 mg/L NAA，生根率達92.02%。

表6 不同激素對組培苗生根的影響

注：K1、K2、K3分別表示水平1、水平2、水平3的平均指標值，R表示生根率的極差。

表7 不同激素對組培苗生根影響的方差分析

2.5 煉苗和移栽

當瓶苗的根長3～4 cm時，進行煉苗移栽。在移栽前，要先將瓶蓋打開適應一個星期，然后小心取出苗，不要傷及根系，用自來水沖凈根部培養基。移栽基質為黃心土∶蛙石按1∶1混合，栽后澆透水，并噴施800倍液多菌靈，蓋膜保濕，遮陰網遮陰，保持溫度在25 ℃左右，相對濕度80%左右。噴水2～3次/d，3 d后適當通風，7 d后去掉遮陰網并減少噴水次數。

3 結論與討論

3.1 無菌體系的建立

70%乙醇和0.1% HgCl2混合使用作為消毒劑，是由于70%乙醇不能徹底殺菌，一般不能單獨使用，但是70%乙醇的濕潤作用強，可以排除掉材料表面的空氣，有利于其他消毒劑的滲入，因此兩者配合使用[6]。試驗結果表明，0.1% HgCl2處理時間越短，消毒不徹底，外植體污染率越高；0.1% HgCl2消毒時間過長，雖然污染率降低，但外植體受到傷害，褐化死亡率增加。當消毒時間為6 min時，雖然外植體污染率不是最低，還存在一定的污染情況，但是此時腋芽成活率最高，顯著高于其他各處理。因此，兼顧消毒效果及對外植體傷害程度我們篩選出75%乙醇10 s+0.1% HgCl26 min對外植體進行滅菌。

3.2 腋芽誘導

在本研究中，BA、IBA均可以提高腋芽培養的誘導率，BA的作用明顯優于IBA的影響。當BA為2.0 mg/L，IBA為0.1 mg/L時，雖然增殖系數最高，但愈傷生長狀況普遍較差，能夠用于增殖培養的有效芽數量少。當IBA為0.2 mg/L時，誘導率雖然不是最高，但愈傷組織普遍生長狀況良好，緊密、淺綠色，隨著培養時間增加，有較多的小芽點。此時在培養基中添加BA，隨著BA濃度的升高，啟動率、有效增殖數均升高。因此，促進腋芽愈傷組織分化的最佳培養基配方：MS+2.0 mg/L BA+0.2 mg/L IBA。

3.3 增殖誘導

無菌苗的增殖研究是植物組培再生體系建立的關鍵環節，是植物快速增殖的根本。試驗表明，低濃度的BA有利于腋芽的增殖，當其濃度過高時，幼苗呈半透明狀、淺黃綠色、生長緩慢、葉片數少、玻璃化嚴重，這與珠美海棠(Maluszumi)[7]、蘆薈(Aloeveravar. chinese)[8]在組織培養中研究的結果相一致。BA適宜濃度是2.5 mg/L，NAA濃度的變化對苗長勢影響程度不明顯，但對愈傷的影響較大，當NAA濃度高于0.2 mg/L時容易導致叢生芽形成大量愈傷組織，隨著NAA濃度的升高，愈傷變得疏松，顏色由黃綠變為淡黃或白色(為無效愈傷)；而低于0.1 mg/L時芽分化少，長勢慢。因此增殖效果最佳組合是BA濃度為2.5 mg/L、NAA濃度為0.2 mg/L，此時可獲得增殖系數高、生長旺盛的叢生芽，有利于進一步進行生根培養。

3.4 生根培養

生根培養是試管苗快速繁殖的基礎，國內外學者對于不同植物組培苗生根的研究做了大量的探索[9-11]。試驗表明，隨著BA濃度增加，試管苗生根的各項指標均相應降低，綜合生根率、平均根數和平均根長3項指標，0.5 mg/L BA的生根效果最好。當BA濃度為0.5 mg/L時，隨NAA含量的增加，生根率、平均根數和平均根長都是先增加后降低。當NAA含量為0.2 mg/L時，試管苗發根快，長度、粗度適中，并且顏色為黃白色，須根多，植株長勢良好，因此誘導生根率最高的培養基配方為MS+0.5 mg/L BA+0.2 mg/L NAA。

[1] 王賢榮.中國櫻花品種圖鑒[M].北京：科技出版社，2014：7-12.

[2] Li C L, Bruce B.Cerasus[M]//Wu Z Y, Raven P H. Flora of China. Louis: Missouri Botanical Garden Press, 2003: 404-420.

[3] 伊賢貴.武夷山櫻屬資源調查及開發利用研究[D].南京：南京林業大學，2007.

[4] 謝春平.不同居群野生早櫻形態特征及其群落學研究[D].南京：南京林業大學，2007.

[5] 王文房，李修嶺.櫻花花柄的組織培養[J].安徽農業科學，2006，34(22)：5839-5841.

[6] 曹孜義,劉國民.實用植物組織培養技術教程[M].蘭州：甘肅科學技術出版社,1999.

[7] 李云,田亭,羅曉芳.珠美海棠試管苗玻璃化發生機理的初步研究[J].北京林業大學學報,1996,(1):52-58.

[8] 豐鋒,李洪波,謝建英.蘆薈組織培養中試管苗玻璃化的發生與防止[J].西南農業大學學報,2001,23(5):249-251.

[9] 李靜.幾種名貴觀賞植物的快速繁殖[J].河北農業大學學報,1997,20(1):30-36.

[10] Klerk G J. Rooting of microcuttings: theory and practice[J]. In Vitro cell. Dev. Biol Plant, 2002, 38(5):415-422.

[11] Kris Pruski, Tess Astatkie, Jerzy Nowak.Tissue culture propagation of Mongolian cherry (Prunusfruticosa) and Nanking cherry (Prunustomentosa)[J]. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 2005, 82(2): 207-211.

(責任編輯：曾小軍)

Study on Tissue Culture and Rapid Propagation Technique of Oriental Cherry New Variety Baiyujiye

LUO Gui-jie, JIN Qian, CHEN Fen

(Suqian Institute of Agricultural Sciences, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Suqian 223800, China)

The one-year-old stems with axillary buds of oriental cherry new variety Baiyujiye were selected as explants, and the experiments in the sterilization, initiation, proliferation and rooting culture of the explants were carried out. The results showed that the best sterilization procedure for explants was 0.1% HgC12for 6 minutes after 75% alcohol for 30 seconds, and their survival rate could reach 51.33%. The optimal medium for the inducement of axillary bud was MS+2.0 mg/L BA+0.2 mg/L IBA, and the inducement rate was 72.65%. The optimum medium for the proliferation was MS+2.5 mg/L BA+0.2 mg/L NAA, and the proliferation coefficient was 5.76. The best medium for the rooting was MS+0.5 mg/L BA+0.2 mg/L NAA, and the rooting rate reached 92.02%.

Oriental cherry Baiyujiye; Tissue culture; Rapid propagation

2017-02-24

2016年江蘇省宿遷市農業科技自主創新資金項目(SQCX2016-03)。

羅桂杰(1981─)女，江蘇宿遷人，助理研究員，碩士，從事林木、果樹、花卉方面的研究。

Q949.751.8

A

1001-8581(2017)07-0044-04