江蘇H9N2亞型禽流感病毒HA和NA的遺傳進化分析

吳 青,李 銀,李祥瑞,趙冬敏,劉青濤,劉宇卓,韓凱凱,黃欣梅

(1.江蘇省農業科學院，江蘇 南京 210014;2.南京農業大學，江蘇 南京 210095)

江蘇H9N2亞型禽流感病毒HA和NA的遺傳進化分析

吳 青1,2,李 銀1*,李祥瑞2*,趙冬敏1,劉青濤1,劉宇卓1,韓凱凱1,黃欣梅1

(1.江蘇省農業科學院，江蘇 南京 210014;2.南京農業大學，江蘇 南京 210095)

為了解江蘇H9N2亞型禽流感病毒(AIV)的變異情況,采用RT-PCR技術對10株從江蘇不同地區分離的H9N2亞型禽流感病毒的HA和NA基因進行了擴增、克隆、測序和遺傳進化分析。結果顯示：10株H9N2病毒間HA基因核苷酸和氨基酸的同源性分別是94.3%～99.0%、93.8%～99.6%,NA基因核苷酸和氨基酸的同源性分別是94.9%～99.9%、95.2%～100.0%,它們均屬于歐亞分支中的A/Duck/Hong Kong/Y280/97亞群;10株病毒的HA裂解位點均為RSSR-GLF，受體結合位點第198位有8株為蘇氨酸，2株為丙氨酸,第191位有1株為組氨酸;10株病毒NA基因在62～64位均存在缺失的現象,從而導致61位的糖基化位點缺失,NA基因第402位均出現了由天冬酰胺(N)到天冬氨酸(D)的變異,8株病毒只具有6個糖基化位點。

江蘇；H9N2亞型；禽流感病毒；HA；NA；遺傳進化

禽流感(Avian Influenza)被世界動物衛生組織(OIE)列入A類傳染病,被中國列為一類傳染病。H9N2亞型禽流感病毒(Avian Influenza Virus, AIV)屬于低致病性禽流感病毒(LPAI),家禽感染此病毒后發病率和死亡率較低,臨床表現為無癥狀帶毒(隱性感染)、產蛋量下降、呼吸系統疾病等。但是,因為H9N2亞型禽流感病毒具有傳播性強、變異快、逐步突破哺乳動物屏障等特點[1],因此其不僅給家禽養殖業帶來了損失,而且對人和哺乳動物的健康也構成了潛在威脅。我國1994年首次報道從雞群分離到H9N2亞型AIV[2],目前,全國各省都有H9亞型AIV的流行。自1999年以來,我國不斷有人感染H9N2病毒的報道[3],其中2013年暴發的人感染H7N9亞型AIV與H9N2亞型AIV關系密切,已證實其內部基因是通過基因片段重組從H9N2亞型AIV獲得的[4]。

血凝素(Hemagglutinin, HA)是構成病毒囊膜纖突的主要成分之一,在病毒吸附及穿膜過程中起關鍵作用,是所有流感病毒蛋白中最重要的1個。在AIV感染時,只有在HA蛋白裂解的情況下才能使病毒囊膜和小泡膜融合以及破裂。因此,HA蛋白的可裂解性對病毒的毒力有著至關重要的作用[5]。HA的第234位氨基酸非常關鍵[6],若是谷氨酰胺(Q),則易與唾液酸(sialic acid, SA)α-2,3-Gal受體結合；若為亮氨酸(L),則與SA α-2,6-Gal受體結合；人流感病毒優先結合SA α-2,6-Gal受體,AIV則易與SA α-2,3-Gal受體結合[7]。HA糖基化位點不僅在介導病毒傳播和受體結合方面起作用,而且能夠保護病毒免受機體免疫系統的作用[8]。有關研究表明HA糖基化的改變不僅影響病毒對宿主細胞的識別,而且影響自然殺傷細胞對感染細胞的識別。神經氨酸酶(Neuraminidase, NA)也是流感病毒粒子表面的1個重要抗原,NA可以將位于宿主細胞表面的流感病毒受體末端的唾液酸殘基切斷,從而使病毒成功侵染細胞[9]；同時,NA可以切斷子代病毒受體末端的唾液酸殘基,使得病毒釋放和成熟[10]。HA的受體結合特性和NA的受體裂解特性相互適應,共同發揮作用。HA和NA的變異會引起AIV的抗原漂移以及抗原轉變,對于禽流感病毒的毒力具有很大的影響[11]。因此,對H9N2病毒的HA和NA進行遺傳進化分析有著十分重要的意義。本研究中,我們對2016年從江蘇各地區分離的H9N2亞型禽流感病毒HA和NA基因進行了遺傳進化分析,以期為深入研究H9N2亞型禽流感病毒提供分子依據。

1 材料與方法

1.1 病毒

采集江蘇省內部分地區家禽的肛拭子和咽拭子,將拭子置于運輸液(加入四抗的PBS)中,將棉拭子擠壓后棄去,以5000 r/min離心10 min后取上清；吸取上清液0.2 mL，接種9～10日齡的SPF雞胚(購于南京天邦生物科技有限公司)；收集接種后24～96 h死亡的雞胚尿囊液,經HA和HI鑒定,將H9N2陽性尿囊液在-70 ℃下保存備用。

1.2 主要試劑

液體病毒RNA/DNA抽提試劑盒、凝膠回收試劑盒購自Axygen生物科技有限公司;first-strand反應緩沖液、High Pure dNTPs (10 mmol/L)、Rnase Inhibitor(40 U/μL)、反轉錄酶AMV、dNTPs (2.5 mmol/L)、Mg2+(25 mmol/L)、Ex Taq反應緩沖液(10×)、Ex Taq酶均購自TAKARA公司;通用引物Uni12由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.3 引物合成

參照GenBank中H9N2 AIV的基因序列,應用Primer 5.0設計引物(見表1),交由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

表1 HA和NA的PCR擴增引物序列

1.4 提取病毒RNA并進行反轉錄

用RNA提取試劑盒提取雞胚尿囊液中H9N2流感病毒的總RNA。反轉錄采用20 μL體系,包括dNTPs 2 μL、5×AMV Buffer 4 μL、Reverse Transcriptase XL(AMV) 0.5 μL、Recombinant Rnase Inhibitor 0.5 μL、Unit12 1 μL、RNA 12 μL。反應程序為65 ℃ 5 min,42 ℃ 60 min,98 ℃ 5 min。

1.5 擴增目的片段并測序

以反轉錄產物為模板進行PCR擴增。PCR反應體系為25 μL,其中雙蒸水14.75 μL,10×PCR Buffer 2.5 μL,25 mmol/L MgCl21.5 μL,dNTP (2.5 mmol/L)2.0 μL,上、下游引物(25 pmol/μL)各1.0 μL,模板DNA 2.0 μL,Ex Taq (5 U/μL)0.25 μL。PCR反應程序: 94 ℃預變性5 min;94 ℃變性40 s,52 ℃退火40 s,72 ℃延伸3 min,共35個循環;72 ℃延伸10 min。在循環反應結束后,對擴增產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測,對PCR產物進行膠回收。將回收產物送至南京金斯瑞生物科技有限公司進行測序。

1.6 HA、NA基因序列分析

用Lasergene 7.1 DNAStar軟件對HA、NA基因進行序列拼接、同源性分析,并對潛在糖基化位點、唾液酸結合位點進行分析。用MEGA 5.0對10株病毒的HA、NA基因序列與GenBank中已發表的H9N2亞型AIV經典毒株進行遺傳進化分析,繪制進化樹。參考毒株的名稱如下: TU/WS/1/66、CK/HK/Y280/1997、CK/BJ/1/1994、CK/SH/F/98、CK/HK/G9/1997、 CK/GX/10/1999、Quai/HK/G1/97、DK/HK/Y439/1997、CK/JS/HA/2012、CK/HB/31/2000。

2 結果與分析

2.1 HA、NA基因擴增及序列測定

分別提取10株H9N2亞型禽流感病毒的RNA,用RT-PCR方法擴增HA、NA基因片段。10株病毒的代號及簡稱如下:A/Chicken/Jiangsu/01/2016(簡稱A/CK/JS/01/16)、A/Chicken/Jiangsu/02/2016(簡稱A/CK/JS/02/16)、A/Chicken/Jiangsu/03/2016(簡稱A/CK/JS/03/16)、A/Chicken/Jiangsu/04/2016(簡稱A/CK/JS/04/16)、A/Chicken/Jiangsu/05/2016(簡稱A/CK/JS/05/16)、A/Chicken/Jiangsu/06/2016(簡稱A/CK/JS/06/16)、A/Chicken/Jiangsu/07/2016(簡稱A/CK/JS/07/16)、A/Chicken/Jiangsu/08/2016(簡稱A/CK/JS/08/16)、A/Chicken/Jiangsu/09/2016(簡稱A/CK/JS/09/16)、A/Chicken/Jiangsu/10/2016(簡稱A/CK/JS/10/16)。

2.2 HA、NA基因同源性分析

通過DNAStar軟件比較分析,得出10株H9N2病毒間HA基因核苷酸的同源性為94.3%～99.0%,推導氨基酸同源性為93.8%～99.6%;NA基因核苷酸的同源性為94.9%～99.9%,推導氨基酸同源性為95.2%～100.0%。10株病毒與H9N2亞型禽流感病毒歐亞分支中Y280-like亞系代表株CK/HK/Y280/1997的親緣性較近,HA基因核苷酸同源性為89.5%～90.4%,推導氨基酸同源性為91.0%～92.5%;NA基因核苷酸同源性為91.1%～94.1%,推導氨基酸同源性為91.3%～94.3%。

2.3 HA、NA蛋白氨基酸序列分析

將10株病毒與歐亞分支Y280-like亞系代表株CK/HK/Y280/1997進行比較分析。HA蛋白的基因裂解位點第335～341位為RSSR-GLF,只有1個堿性氨基酸,符合H9N2亞型AIV典型的低致病性特征;第198位受體結合位點有8株病毒由纈氨酸(V)變異為蘇氨酸(T)，2株變異為丙氨酸(A),可能會導致H9N2亞型AIV與細胞受體的結合力發生變異,對AIV的流行性可能起重要作用;第234位氨基酸與受體唾液酸α-2,3-半乳糖和唾液酸α-2,6-半乳糖的結合特性有關,禽類的H9N2亞型 AIV的第234位大多為谷氨酰胺(Q),與唾液酸α-2,3-半乳糖受體結合。而在本研究中10株病毒第234位均突變為亮氨酸(L)(表2),易與唾液酸α-2,6-半乳糖受體結合,可能引發人感染。上述結果表明這10株病毒存在引發人和其他哺乳動物流感的潛在可能。

N-糖基化位點(擁有N-X-T/S基序,X為除P以外的氨基酸)被證實對于維持蛋白分子的結構和正常生物學功能具有重要意義。10株病毒HA蛋白的第313位均由脯氨酸(P)變異為絲氨酸(S),因而在第313位新增加了1個糖基化位點;9株病毒的第218位糖基化位點由蘇氨酸(T)變異為異亮氨酸(I),1株病毒由蘇氨酸(T)變異為纈氨酸(V)(表2),導致第218位糖基化位點缺失；10株病毒NA蛋白第63位缺失,導致第61位的糖基化位點缺失;第402位由天冬酰胺(N)變異為天冬氨酸(D),導致10株病毒第402位糖基化位點缺失;8株病毒第264位由絲氨酸(S)變異為精氨酸(R),1株由異亮氨酸(I)變異為纈氨酸(V),導致9株病毒缺失了第264位糖基化位點(表3)。

唾液酸結合位點,即紅細胞結合位點(hemadsorbing site, HB)位于NA蛋白的表面,遠離神經氨酸酶酶活性區域,對病毒的復制具有重要作用。對10株病毒NA蛋白HB位點氨基酸變異情況的分析結果如表3所示:10株病毒在431～433位氨基酸比較保守,均為PQE;而在366～373區域的368、369 位氨基酸出現較大變異。

表2 H9N2亞型AIV HA基因的特殊位點

2.4 HA、NA遺傳進化分析

將10株病毒的HA、NA基因核苷酸序列與參考毒株進行比較,并繪制系統進化樹。如圖1、圖2所示:10株病毒的HA、NA基因均屬于歐亞分支中以DK/HK/Y280/97為代表株的Y280-like亞分支。

3 討論

H9N2亞型AIV是低致病性流感病毒,主要表現為高感染率和低死亡率,能引起家禽生產性能下降和免疫抑制,繼發細菌感染后能造成家禽死亡,嚴重影響家禽業生產。禽流感病毒變異后能在人、家禽、豬體之間循環,有的能直接感染人,有的為感染人的病毒提供基因,如:2003年香港發生H9N2亞型禽流感病毒感染人的疫情,2013年感染人并引起較高死亡率的H7N9亞型禽流感病毒的6個內部基因也均來自H9N2病毒[12]。H9N2病毒的 8個基因片段為適應新的宿主環境在不斷發生變化,以表面基因HA和NA的變化最為顯著。本研究中的10株H9N2亞型流感病毒與參考毒株HA基因核苷酸及推導的氨基酸序列的同源率分別在89.5%～90.4%、91.0%～92.5%,NA基因核苷酸及推導的氨基酸序列的同源率分別在91.1%～94.1%、91.3%～94.3%。這就表明HA基因和NA基因隨著時間的變化,其突變在積累。

表3 H9N2亞型AIV NA基因的特殊位點

HA蛋白是流感病毒重要的表面糖蛋白,含有與病毒生物學功能相關的多個功能域,這些區域的一些氨基酸變化可能導致病毒的一些生物學功能的改變[13]。在一般情況下,高致病性禽流感病毒的裂解位點附近有多個堿性氨基酸插入,而低致病力毒株的裂解位點附近只有1個或沒有堿性氨基酸。本研究中的10株病毒裂解位點均為RSSR-GLF,只有1個堿性氨基酸,具有低致病性禽流感病毒的分子特點。HA基因第234位受體結合位點變化顯著,均由谷氨酰胺(Q)突變為亮氨酸(L),受體結合位點的突變可能引起流感病毒在自然進化過程中與細胞受體的親和力發生變異。

糖基化位點能防止抗體結合對病毒的中和作用[14],是改變禽流感病毒毒力的重要因素之一。在本研究中，9株病毒HA蛋白第218位由蘇氨酸(T)變異為異亮氨酸(I),1株病毒由蘇氨酸(T)變異為纈氨酸(V)(表2),導致第218位糖基化位點缺失;第 313位由脯氨酸(P)變異為絲氨酸(S),因而第313位新增加了1個糖基化位點。較早的研究表明,中國大陸地區H9N2亞型AIV的NA蛋白中第63、264、402位潛在糖基化位點高度保守[15]。本研究中10株病毒NA蛋白第63位缺失,從而導致61位的糖基化位點缺失;第402位由天冬酰胺(N)變異為天冬氨酸(D),導致10株病毒第402位糖基化位點缺失;8株病毒第264位由絲氨酸(S)變異為精氨酸(R),1株由異亮氨酸(I)變異為纈氨酸(V),導致9株病毒缺失了第264位糖基化位點。與早期報道相比,本研究中病毒NA蛋白潛在的糖基化位點出現了較多的變異,這是否會影響病毒的生物學特性還有待進一步研究。

在NA基因的血凝素結合位點367～372位、399～404位和431～433位共同形成了3個環狀結構,而環狀結構中的氨基酸與唾液酸直接結合[16]。在本研究中，10株病毒的NA基因的血凝素結合位點HB的367～372位的氨基酸發生了變異,這可能會降低與唾液酸結合的活性,但是否會引起H9N2禽流感病毒的致病力增強尚未可知。

本研究對江蘇各地區2016年分離的10株H9N2亞型AIV的HA、NA基因進行了序列分析。結果表明,HA蛋白第218位潛在糖基化位點缺失,在第313位新增潛在糖基化位點,此變異對病毒致病力的影響有待進一步研究。此外，NA蛋白的糖基化位點、HB位點發生了較大變異；值得注意的是,HA蛋白的第234位氨基酸均為L,說明這10株病毒具有潛在感染人的特性。H9N2亞型AIV能引起家禽的免疫抑制,若繼發細菌感染則可造成家禽的大量死亡,會給養禽業帶來巨大的經濟損失。因此加強H9N2亞型AIV流行病的監測與研究,對畜禽生產和公共衛生都有非常重要的意義。

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(責任編輯:黃榮華)

Genetic Evolution Analysis of H9N2-subtype Avian Influenza Viruses HA and NA in Jiangsu Province

WU Qing1,2, LI Yin1*, LI Xiang-rui2*, ZHAO Dong-min1,LIU Qing-tao1, LIU Yu-zhuo1, HAN Kai-kai1, HUANG Xin-mei1

(1. Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China;2. Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

In order to understand the variation situation of H9N2-subtype avian influenza virus (AIV) in Jiangsu area, we cloned the HA gene and NA gene of 10 H9N2-subtype AIV strains isolated from different regions of Jiangsu by RT-PCR amplification, and carried out the genetic evolution analysis of the HA and NA sequences. The results showed that the homology of nucleotide and amino acid of HA gene among 10 strains was 94.3%～99.0% and 93.8～99.6%, respectively; the homology of nucleotide and amino acid of NA gene among 10 strains was 94.9%～99.9% and 95.2%～100.0%, respectively; ten strains all belonged to A/Duck/Hong Kong/Y280/97 subgroup in Eurasian clade; the HA cleavage sites of all 10 isolates were RSSR-GLF; at the 198th receptor binding site, eight of ten strains had threonine, and two of ten strains had alanine; at the 191st receptor binding site, one of ten strains had histidine; the deletion of the 62～64th sites in NA gene of all 10 strains resulted in the deletion of the 61st glycosylation site; the variation from asparagine (N) to aspartic acid (D) occurred at the 402nd site of NA gene, and eight of ten H9N2-subtype AIV strains had only six glycosylation sites.

Jiangsu; H9N2 subtype; Avian influenza virus; HA; NA; Genetic evolution

2017-03-28

江蘇省農業科技自主創新資金項目[cx(14)2091、cx(15)1058]。

吳青,女,碩士,主要從事動物病毒病分子生物學研究。*通訊作者:李銀、李祥瑞。

S858.3

A

1001-8581(2017)07-0104-06