動態濁度法測定注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀細菌內毒素含量

李慧，張彥麗，崔曉燕，劉琳，劉云

(1.河北省石家莊市食品藥品檢驗中心，河北石家莊050031；2.河北省藥品檢驗研究院，河北石家莊050011)

·檢驗檢測·

動態濁度法測定注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀細菌內毒素含量

李慧1，張彥麗1，崔曉燕2，劉琳1，劉云1

(1.河北省石家莊市食品藥品檢驗中心，河北石家莊050031；2.河北省藥品檢驗研究院，河北石家莊050011)

目的建立測定注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀細菌內毒素含量的方法。方法按照2015年版《中國藥典（四部）》，采用動態濁度法進行干擾試驗，測定樣品中細菌內毒素的含量。結果當供試品稀釋質量濃度為60 g/L時，無干擾作用，細菌內毒素回收率為50%～200%。結論動態濁度法定量檢測樣品中細菌內毒素，細菌內毒素含量均遠低于藥典規定的0.25 EU/mg，現有標準可作進一步提高。

注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀；細菌內毒素；動態濁度法

注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀是阿莫西林鈉和克拉維酸鉀的復方制劑，是臨床應用廣泛的抗菌藥物[1]，對β－內酰胺酶流感嗜血桿菌和卡他莫拉菌所致下呼吸道感染均具有有效的抑制作用[2]，可用于治療多種感染性疾病。目前，阿莫西林鈉克拉維酸鉀復合制劑的應用越來越普及，甚至超過了單用阿莫西林[3]。另外，其為靜脈滴注，為了保障患者的用藥安全，對其進行細菌內毒素控制有實際意義。細菌內毒素最常用的檢查法一般是鱟試劑試驗法[4]，現行標準用凝膠法進行檢查，為限量檢查法，不能準確測定樣品中的細菌內毒素含量。細菌內毒素動態濁度法[5－6]以凝膠試驗為基礎，通過標準曲線對樣品中內毒素含量進行定量測定[7－9]。參照2015年版《中國藥典（四部）》[10]細菌內毒素檢查法中的動態濁度法，以建立更靈敏、準確的細菌內毒素定量檢測方法。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

64 well Kinetic Tube Reader光度試管儀（英國萊伯金耐特有限公司），TM－1FN型自動漩渦混合器（日本三洋公司）。

1.2 試藥

細菌內毒素工作標準品(中國食品藥品檢定研究院，批號為150601－201580，規格為每支80 U）；動態濁度法鱟試劑(批號為1505080，規格為1.25 m L，檢測范圍為10～0.03 EU/m L）；鱟試劑（批號為1505080，規格為0.1m L，靈敏度為0.25 EU/m L）；BET用水（批號為1503250，規格為5m L），均由湛江安度斯生物有限公司提供。注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀（H生產企業，批號分別為078160551，078160552，078160553）。

2 方法與結果

2.1 細菌內毒素限值（L）的確定

按照2015年版《中國藥典》規定，L＝K/M，其中K為人用每1 kg體質量每1 h最大可接受的內毒素劑量，K＝5 EU/(kg·h）；M為人用每1 kg體質量每1 h最大供試品劑量，根據說明書，每1 h內可能的最大給藥劑量為1.2 g，人均體質量按60 kg計算，L定為0.25 EU/mg為宜，與藥典規定一致。

2.2 標準曲線的建立和可靠性分析

取細菌內毒素標準品1支，用BET用水溶解并進行稀釋，使其最終濃度分別為2.0，0.5，0.125，0.031 25 EU/m L，分別取0.1mL加至預先加有0.1m L動態濁度法鱟試劑的反應管內，混合均勻，插入動態試管儀內進行檢測，其中每一濃度平行加3管，同時用BET用水作為陰性對照。以平均反應時間的對數（lg T）為縱坐標，內毒素濃度的對數值（lgC）為橫坐標，制作標準曲線。結果見表1。

結果表明，標準曲線回歸方程為lg T＝2.811 7－0.241 1 lgC，相關系數(r)＝－0.9952(絕對值應＞0.980)。平行管之間的變異系數均小于2%，陰性對照反應時間大于標準曲線最低濃度的反應時間，細菌內毒素標準曲線成立。

2.3 干擾試驗

取供試品(批號為078160551，規格為1.2 g)，加BET用水10 mL溶解，制成質量濃度為120 g/L的溶液，將其稀釋2，10，20，50倍備用（A液）；制備含0.5 EU/m L（λm）內毒素的不同稀釋倍數的供試品溶液（B液）；同時制備0.031 25，0.125，0.5，2.0 EU/mL內毒素溶液（C液）；陰性對照管為BET用水（D液）。分別取上述溶液各0.1 m L加入預先加有0.1m L試劑的反應管中，每一濃度平行加2管，混勻，立即置Kinetic Tube Reader光度試管儀進行檢測，結果見表2。

表1 細菌內毒素標準曲線與可靠性分析結果

表2 供試品干擾試驗結果

表4 凝膠法細菌內毒素檢查結果

供試品在稀釋質量濃度為60，12，6，2.40 g/L的條件下，回收率為50%～200%，供試品稀釋濃度為60 g/L時，回收率表現最好，且內毒素檢測值準確計算，能更好地反映供試品細菌內毒素含量情況，故選擇稀釋質量濃度為60 g/L為檢測質量濃度。取批號為078160551，078160552，078160553的供試品，依法檢測，結果見表3。

2.4 凝膠法細菌內毒素檢查

根據干擾試驗結果，采用0.25 EU/mL鱟試劑，根據公式C＝λ/L，將供試品溶液稀釋至1 g/L，采用凝膠法進行細菌內毒素檢查。結果見表4。

3 討論

動態濁度法是在凝膠法基礎上發展起來的細菌內毒素定量檢測方法。目前，復合制劑在臨床的應用越來越廣泛，諸如輸液反應等也廣受關注，動態濁度法定量測定復合制劑中細菌內毒素含量為其臨床應用提供了可靠參考[11]。此方法靈敏度高，操作便捷，一方面，檢測范圍較凝膠法寬，準確定量，重復性好，可實時觀察與分析干擾試驗和樣品檢測情況；另一方面，節約檢驗成本，簡化操作環節，提高檢測效率。這些優勢使該方法在藥品細菌內毒素檢測的應用中日益普遍。

本研究中采用動態濁度法定量測定注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀中細菌內毒素的含量，試驗中樣品在不同稀釋質量濃度下，細菌內毒素回收率均在50%～200%。采用動態濁度法能準確檢測樣品中細菌內毒素含量，且樣品溶液在高質量濃度就能排除干擾測得定量數據，稀釋倍數高于現行標準，能準確測定注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀中細菌內毒素含量。因此，本研究建立的注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀內毒素定量檢測方法可行。

通過采用動態濁度法測定不同生產廠家樣品中細菌內毒素含量，比較各樣品的內毒素含量差異，可進一步比較不同廠家的生產工藝及控制方法，可進一步提升現有標準。

[1]梁麗文.注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀溶液的穩定性分析[J].求醫問藥（下半月），2013，11（1）：190.

[2]嚴燁.探討注射用阿莫西林鈉克拉維酸鉀溶液的穩定性[J].數理醫藥學雜志，2014，27（6）：705－706.

[3]劉皈陽，于鋒英，陳超，等.阿莫西林與阿莫西林克拉維酸鉀不良反應的對比研究[J].藥物不良反應雜志，2010，12（6）：397－400.

[4]張虞婷，丁蘇蘇，李倚云.細菌內毒素的研究進展及其檢查法的應用[J].天津藥學，2015，27（5）：66－69.

[5]中國藥品生物制品檢定所.中國藥品檢驗標準操作規程[M].北京：中國醫藥科技出版社，2005:278.

[6]楊晨曦.細菌內毒素試驗凝膠定性法與動態濁度定量法的比較[J].臨床血液學雜志，2010，23(6):366－368.

[7]湯京義.細菌內毒素試驗常用定性與定量法的比較[J].秦山醫學院學報，2011，32(7)：542－544.

[8]朱佳麗，段鵬，曹慧，等.動態濁度法定量測定碘克沙醇中細菌內毒素的含量[J].中國藥師，2016，19（2）：384－386.

[9]李長根.動態濁度法測定紅花注射液中細菌內毒素的含量[J].海峽藥學，2015，27（4）：50－52.

[10]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（四部）[M].北京:中國醫藥科技出版社，2015：154－157.

[11]申應德，張新，李杰，等.動態濁度法測定吡拉西坦氯化鈉注射液中細菌內毒素含量[J].中國藥品標準，2016，17（1）：41－43.

Content Determ ination of Bacterial Endotoxin in Am oxicillin Sodium and Clavulanate Potassium for Injection by K inetic Turbidim etric M ethod

Li Hui1,Zhang Yanli1,Cui Xiaoyan2,Liu Lin1,Liu Yun1
(1.Shijiazhuang Institute for Food and Drug Control,Shijiazhuang,Hebei,China 050031; 2.Hebei Provincial Institute for Drug Control,Shijiazhuang,Hebei,China 050011)

Ob jective To establish a method for determining the content of bacterial endotoxin in Amoxicillin Sodium and Clavulanate Potassium for Injection.M ethods According to the Chinese Pharmacopoeia 2015 Edition fourth section,kinetic turbidimetric method was used for the interference test of Amoxicillin Sodium and Clavulanate Potassium for Injection and determining the content of bacterial endotoxin in samples.Results The interference was eliminated when the sample was diluted to 60 g/L,the recovery rate of bacterial endotoxin was within 50%－200%.Conclusion Dynamic turbidimetry can be used for bacterial endotoxin in test of Potassium Clavulanate and Amoxicillin for Injection,the content of bacterial endotoxin is less than the standard of Chinese Pharmacopoeia 0.25 EU/mg, and the current standard can be further improved.

Amoxicillin Sodium and Clavulanate Potassium for Injection;bacteria endotoxin;kinetic turbidimetric method

R446.5

A

1006－4931(2017)09－0026－03

2016－11－23；

2017－02－04)

10.3969/j.issn.1006－4931.2017.09.008

李慧(1982－)，女，碩士研究生，主管藥師，研究方向為藥理學及藥物分析，（電子信箱）190635814＠qq.com。