細胞癌細胞系的建立與生物學特性的關聯研究

袁方，王國利，王艷，吳濤，徐佳

沈陽醫學院

細胞癌細胞系的建立與生物學特性的關聯研究

袁方，王國利，王艷，吳濤，徐佳

沈陽醫學院

目的以原代培養的喉鱗狀細胞癌組織細胞為例，觀測細胞癌細胞系的生物學特性。方法通過組織塊培養法，體外原代培養喉鱗狀細胞癌組織細胞，細胞傳代超過25次時，觀察細胞的樣態、細胞角蛋白的組織化學染色、檢驗細胞增值周期、培養法檢驗支原體、聚合酶鏈反應法（PCR法）鑒別細胞種類、STR-短串聯重復序列基因分型。結果新建立一株喉鱗狀細胞癌細胞系，定名為TR-LCC-1，其大多數形態為多邊形細胞，鋪路石樣變異、疊層生長，除了形態區別于其他細胞外，其體積也比較大。細胞角蛋白的組織化學染色呈陽性。繁衍30代之后，細胞群體倍增時間提高到201.2小時。對細胞間期進行檢驗，發現DNA合成前期（G1期）占51.71%，DNA合成期（S期）占44.56%，DNA合成后期（G2期）占2.28%。培養法檢驗支原體，未發現污染。聚合酶鏈反應法（PCR法）鑒別TR-LCC-1種類屬于人來源細胞。對STR-短串聯重復序列進行檢驗，發現P26與P6一致，異于已知細胞的短串聯重復序列。結論人來源喉鱗狀細胞癌的細胞系TRLCC-1，可以作為樣本以研究喉鱗狀細胞癌的特性。

喉腫瘤細胞；鱗狀細胞；原代培養；細胞系；生物學特性

近些年，我國癌癥發病率普遍提高，對于喉癌等這類常見頭頸疾病來說，國內主要采用手術與化療結合治療的方式，但效果不明顯，生存5年以上的比例幾乎未見變化。特別是中晚期喉癌患者，放療之后往往還需要切除病變器官，以致于患者呼吸困難、無法正常發音，對其心理、生理造成雙重影響。所以，提高治療技術，對喉腫瘤細胞系進行生物學研究，尋找新的醫學手段，迫在眉睫。對喉腫瘤細胞進行體外培養，建立喉腫瘤細胞系，是分析病變細胞的生物學特性、形態特性等的前提條件，但是，當前我國的形勢是：能夠試驗用的喉鱗狀細胞癌組織細胞十分有限，而原來的Hep-2細胞株大多數已經被同實驗室的HeLa細胞系污染，失去了研究價值。所以，醫學界只能利用組織塊培養法原代培養喉鱗狀細胞癌細胞，把建立的新細胞系取名為TR-LCC-1，并應用于喉癌細胞的試驗研究，分析生物學特性，鑒別其種類。

1 試驗方法

1.1 試驗材料

喉鱗狀細胞癌組織細胞，對未壞死部分進行組織塊培養。

1.2 方法

1.2.1 癌細胞組織建系過程

（1）在無菌的操作模式下，在未壞死喉癌細胞組織上取2X2cm的材料標本，選取部位要求其顏色為魚白色、質地要統一、柔軟且有光澤。

（2）用無菌生理鹽水清洗標本兩次之后，快速侵入到組織細胞培養基礎液中（青霉素含量200U/ml,鏈霉素含量200mg/L,二性霉素B含量2mg/L），在4℃條件下，浸泡2h～3h。

（3）無菌生理鹽水（含青霉素、鏈霉素及二性霉素B）及RP?MI-1640培養基（10%牛血清）分別沖洗三次。

（4）取2個半徑為2～4mm的癌細胞組織塊，分別放置在培養瓶底部進行組織培養。培養條件：培養液含10%血清；培養箱溫度為37℃，CO2為5%，濕度飽和。需要注意：2小時之后，要旋轉培養瓶，以便使喉癌組織小塊在培養液中能夠完全浸泡。

（5）一周之后，若貼壁的的喉癌組織小塊中的細胞融合比例達到60%，則進入細胞消化傳代培養階段，頻率為每周1到2次。另外，可用反復貼壁方法分離、清除成纖維細胞。

1.2.2 免疫細胞化學染色

（1）用蓋玻片接種細胞，并使其呈單層排列

（2）采用PBS-磷酸鹽緩沖液（磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉）沖洗細胞，浸入甲醇-丙酮固定液中，使細胞保持原有狀態、結構。

（3）蘇木精-伊紅染色（HE染色）、細胞角蛋白免疫組化染色。

1.2.3 MTT（四甲基偶氮唑藍比色法）檢測細胞增殖情況

（1）用胰酶降解、消化對數生長期階段的細胞，配制細胞懸液。

（2）充分混勻細胞懸液之后，利用血球計數板進行細胞顯微計數，分別在每個孔中滴入100ul，采用24孔板，共5張，有序擺放在培養箱（37℃，co2:：5%）內，持續檢驗5天。

（3）隔天，在距結束細胞培養4h的時間段，在每個中孔滴入50mg四甲基偶氮唑藍溶液。

（4）經過4h之后，用吸管清除培養基液，并在每個孔中滴入100ul的二甲基亞砜（DMSO）。

（5）置于振蕩器上5～10min，用波長為570nm的酶標儀進行吸光度檢測。

1.2.4 PI-FACS（碘化丙啶染色法）檢測細胞增殖周期

當細胞增殖，使其覆蓋率達到80%時，進行胰酶蛋白消化處理；離心細胞5min，1200r/min；用磷酸緩沖鹽溶液（4℃、PH值在7.2～7.4之間）沖洗細胞組織；在乙醇含量為70%的溶液中固定1h以上；離心細胞5min，1500r/min；在1.0～1.5ml細胞染色液中進行細胞重懸，預計細胞的上機通過率能在200～350cell/s時，上機檢驗。

1.2.5 支原體檢測

利用分離培養法檢驗支原體是否被感染，在保障細胞上機通過率為200～350cell/s時，置于瓊脂平板上，顯微檢測是否有特征性病變。

1.2.6 STR--短串聯重復序列檢測

提取并分離DNA，檢驗其熒光信號，對比分析STR。

2 結果

2.1 形態觀察

利用倒置相差顯微鏡觀察細胞系TR-LCC-1，發現其大多呈多邊形狀態，似鋪石路樣疊層增殖。經蘇木精—伊紅染色法發現，其異型性明顯，細胞核和細胞質比重加大，核仁數量突增，不對稱性、三極性及多極性核分裂等現象增加。

2.2 免疫細胞化學染色

經免疫組織化學細胞角蛋白染色結果分析，發現鱗狀上皮細胞AE1/AE3值高，由此證明，細胞系TR-LCC-1歸屬于上皮細胞。

2.3 體外培養情況

TR-LCC-1細胞系在進入對數生長階段初始，增殖速度迅速，于第三天達到頂峰。細胞倍增時間達到201.2小時。

2.4 細胞周期分析

周期結果檢驗測定：G1期為51.7%，S期為44.56%，M期為1.45。

2.5 特性檢測結果

支原體（培養法）顯示為陰性。PCR法（聚合酶鏈反應法）檢驗結果顯示細胞系TR-LCC-1屬于人來源細胞。其中P26和P6的STR一致，均區別于已知細胞。

3 結論

喉癌屬于較為多見的一種惡性疾病，具可靠數據顯示，其發病率和死亡率都相對較高[2]。在我國，目前的主要治療方式還是采用手術與化療相結合，但是其效果不夠理想，喉癌患者的死亡率仍居高不下[3]，所以加大喉癌細胞的生物學特性的研究力度，建立細胞系，進行體外原代培養，為相關醫學研究奠定了堅實基礎，具有十分重要的現實意義。

[1]羅瑞華，齊金星，翟翼飛.中國居民喉癌死亡水平分析[J].中國衛生產業，2012,（31）:160.