酸棗仁多組分鼻用溫敏凝膠的制備、評價及其聯合釋放研究

王黎　趙寧　李欣　徐啟萌　馬莉　王丹

摘要：以泊洛沙姆P407和泊洛沙姆P188為凝膠材料，甘油或聚乙二醇為保濕劑，制備了復方添加酸棗仁中主要有效成分酸棗仁皂苷a、酸棗仁皂苷b、斯皮諾素的復方多組分鼻用溫敏凝膠。以無膜溶出法進行了凝膠體外釋放評價，以滲透膜法考察了其活性成分的聯合釋放規律，通過f2檢驗法證實凝膠活性成為的體外釋放行為具有協同性。

關鍵詞：溫敏凝膠；酸棗仁；多組分；聯合釋放

中圖分類號：TQ 460.6；R944.6 文獻標識碼：A 文章編號：1671-0460（2017）01-0004-04

酸棗仁（semen Ziziphi Spinosae）屬“藥食同源”藥材，其作用明確、安全性好，具有廣泛的應用前景。其主要用途是中樞鎮靜，鼻腔給藥是一種具有腦靶向的給藥途徑，適用于酸棗仁制劑的給藥形式。鼻用溫敏凝膠劑在體外以溶液狀態存在，滴入鼻腔后，其在體溫的作用下發生相轉變，由液相轉變為具有生物黏附性的凝膠，具有鼻腔滯留時間長、中樞生物利用度高、胃腸道負擔小等特點。

“多組分、多靶點”是中藥的理論精髓和發展前沿嗍。運用現代科學技術手段，以“多組分、多靶點”為理念，將成為我國未來中藥開發的重要趨勢。本文課題組開發了酸棗仁皂苷鼻用溫敏凝膠，取得了良好的效果，但酸棗仁的安神鎮靜作用主要是酸棗仁皂苷a、酸棗仁皂苷b及斯皮諾素協同作用的結果，有必要結合現代制藥技術開發多組分酸棗仁制劑。

1 實驗部分

1.1 儀器

集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（DF-10S型，鞏義市予華儀器有限責任公司）；精密電子天平（92SM-202A-DRSCS型，PRECICA公司）；電熱鼓風干燥箱（DHG9140型，上海安亭科學儀器有限公司）；高效液相色譜儀（P680型，美國戴安公司）。

1.2 試藥

酸棗仁皂苷a、酸棗仁皂苷b、斯皮諾素（百靈威科技）；泊洛沙姆407、泊洛沙姆188（德國BASF公司）；PEG400（天津市福晨化學試劑廠）；甘油（天津市風船化學試劑有限公司）；丙二醇（天津市富宇精細化工有限公司）；尼泊金乙酯（河南佳航化工產品有限公司）；磷酸鹽緩沖溶液自制；色譜乙腈（廣東光華科技股份有限公司），磷酸二氫鉀（西安化學試劑廠），氫氧化鈉（天津市北聯精細化學品開發有限公司），乙二胺四乙酸二鈉（天津市盛奧化學試劑有限公司），無水碳酸鈉（天津市化學試劑三廠）；純凈水（成都娃哈哈昌盛飲料有限公司）。

2 方法與結果

2.1 HPLC測定方法的建立

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Agilentcl8柱（150mm×4.6mm×5μm）；流速：1.0mL/min；柱溫：40℃；進樣量：20μL。

（1）測定斯皮諾素：流動相：乙腈-0.1%冰醋酸溶液，（20：80）；檢測波長：335nm。

（2）測定酸棗仁皂苷a、酸棗仁皂苷b：流動相：乙腈-水（32：68）；檢測波長：204mm。

2.1.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取酸棗仁皂苷a標準品20.0mg、酸棗仁皂苷b標準品20.0mg、斯皮諾素標準品20.0mg，置25mL容量瓶，加甲醇溶解并稀釋至刻度，即得濃度為0.8mg/mL的標準儲備液。臨用時精密量取上述3種溶液各2mL，酸棗仁皂苷a、b同置于一個10mL容量瓶，斯皮諾素置于另-10mL容量瓶，分別加甲醇溶解并稀釋至刻度，即得濃度均為0.16mg/mL的酸棗仁皂苷a、b混合對照品溶液及斯皮諾素對照品溶液。

2.1.3 標準曲線繪制

精密量取上述標準儲備液適量，用流動相分別稀釋成0.008、0.016、0.08、0.4、0.8mg/mL的供試液。0.45μm微孔濾膜過濾，分別按2.1.1下的色譜條件操作，測定酸棗仁皂苷a的峰面積，以峰面積對濃度進行回歸，得到方程Y=33.347X-1.6192，R=0.9996；同法測得酸棗仁皂苷b回歸方程Y=46.894X-0.6868，R=0.9993；測得斯皮諾素回歸方程Y=479.76X+11.233，R=0.9991，均呈現良好的線性關系。

2.2 多組分溫敏型鼻用凝膠制備

2.2.1 人工鼻液的制備

取0.2mol/L磷酸二氫鉀溶液250mL，加0.2mol/L氫氧化鈉溶液118mL，用水稀釋至1000mL，搖勻，即得。

2.2.2 多組分溫敏型鼻用凝膠的制備

稱取P1883g、P4079g，人工鼻液32.5g，保濕劑（甘油或聚乙二醇）3g，磁力攪拌使其分散均勻，于4℃冰箱放置24h，充分溶脹形成澄清透明溶液，即得空白泊洛沙姆溶液。攪拌下在空白泊洛沙姆溶液中加入酸棗仁皂苷a100mg、酸棗仁皂苷b50mg及斯皮諾素50mg，加入4mg尼泊金乙酯作為防腐劑。混勻后即得多組分溫敏型鼻用凝膠。

2.3 無膜溶出法試驗

精密稱取凝膠溶液2mL置5mL試管中，34℃放置10min待其完全膠凝。精密量取人工鼻液1mL加入試管中后精密稱取試管總重。由于鼻腔溫度約為34℃，因此恒溫加熱磁力攪拌器設置溫度為34℃，并且以50r/min的頻率往復振蕩，分別于30、60、90、120、150、180min將上清液傾出，傾出時應保持凝膠不被破壞，傾出后重新加入pH=6.8的磷酸緩沖液1mL后擦干表面精密稱量，前后兩次質量之差即為溶蝕量，計算累計溶蝕量及累計溶蝕率。樣液用水系0.45μm濾頭過濾，以2.1.1下的色譜條件操作，計算酸棗仁皂苷a的累積釋放率。重復以上實驗3次，計算平均累計溶蝕百分率及平均釋放百分率，見表1、表2，圖1-圖4。

2.5 斯皮諾素與酸棗仁皂苷的釋放曲線間相似度考察

酸棗仁皂苷a、b與斯皮諾素在本復方制劑中有協同促進作用，但它們在鼻黏膜上的溶出釋放速率受其溶解度的影響相差較大。黃海英等測定了斯皮諾素的油水分配系數，發現其logP小于1，是一個較親水性的化合物。因此，不適宜的制劑方式將導致不同組分間釋放曲線形成顯著差異，影響協同藥效。有必要尋找適宜的制劑方式，使得這些組分在鼻粘膜處聯合釋放時，形成相似的釋放曲線，從而協同起效。

f₂檢驗法是美國FDA頒布的評價不同釋放曲線相似程度的重要方法，在協同釋放、仿制藥一致性評價等領域有著廣泛的應用。

本文采用f₂檢驗法考察了酸棗仁皂苷與斯皮諾素的釋放行為的協同性，其公式為f₂=50·log（[1+（1/n）∑_t=1ⁿ（R_t-T_t）²]^-0.5·100）。公式中R_t和T_t分別為各取樣時間點酸棗仁皂苷與斯皮諾素的累積溶出率，n為取樣點個數。公式計算結果f₂>50時，表示兩個釋放曲線較一致，兩者的釋放具有一致性。

將酸棗仁皂苷a、b與斯皮諾素的釋放曲線通過f₂檢驗的方式考察其兩兩之間的釋放曲線相似性，結果見表3。

2.4 透析袋法考察多組分聯合釋放情況

將透析袋剪成10至20cm小段，用配制好1mmol/L的EDTA-2Na溶液煮沸10min，最后用純凈水進行漂洗。精密量取酸棗仁皂苷溫敏凝膠2mL置透析袋內，34℃放置10min待其完全膠凝。放入含有120mL磷酸緩沖液pH=6.8的燒杯中。兩頭扎緊并留一部分空氣后將透析袋完全浸沒在溶液內。水溫控制為34℃，轉速50r/min。分別于0.5h及此后每小時取一次樣，直至8h。取樣時用注射器取樣2mL于試管內，且每次在燒杯內補加同溫等量的緩沖液。將所得的樣品經0.45μm的微孔濾膜過濾，分別以2.1.1項下色譜條件測定酸棗仁皂苷a、b與斯皮諾素的量，計算繪制其釋放曲線，如圖5所示。

表3表明，本文中所考察的酸棗仁中多組分鼻腔原位凝膠中的酸棗仁皂苷a、b的體外釋放曲線間f2檢驗結果大于50，意味著酸棗仁皂苷a、b的體外釋放行為基本一致，具有良好的協同效應；酸棗仁皂苷族與斯皮諾素間的f₂檢驗結果在25至50之間，說明斯皮諾素與酸棗仁皂苷族雖不屬于一致性釋放，但仍具有一定的協同釋放作用。

3 討論

中藥鼻腔給藥制劑在我國已有悠久的歷史，我國古代就有通過鼻腔給藥治療中風、昏厥等癥的記載。鼻黏膜在解剖生理上與腦部存在著獨特的聯系，藥物經鼻黏膜吸收后可通過鼻腔嗅上皮的雙極嗅細胞沿嗅神經入腦，發揮中樞治療作用。因此，鼻腔給藥可以提高藥物在腦內的濃度，有腦靶向的作用，可有效提高藥物生物利用度，且吸收迅速、起效陜、無損傷性、使用方便。

本文制備的酸棗仁溫敏凝膠制劑，膠凝溫度適宜，制備工藝簡單，給藥方便，可直接滴入鼻腔，在鼻腔的生理溫度下轉變成凝膠，促進藥物通過鼻腔吸收進而進入中樞發揮治療作用，增加療效。同時由于凝膠的生物粘附性，可大大增加藥物在鼻腔的滯留時間，從而持續提高患者的治療效果，還可降低使用傳統湯劑時的較大給藥劑量，降低患者的胃腸道及排尿負擔，具有一定的應用及開發前景。

多組分中藥的協同釋放問題是目前中藥制劑的研究熱點與前沿。傳統的酸棗仁湯劑中，上述組分在熬制過程中已經溶出，進入體內后各組分同時到達吸收部位，多組分、多靶點同時協同起效。因此，在這種新型多組分中藥制劑的研究過程中，有必要使其聯合釋放過程模擬傳統中藥特點，盡量使釋放的速率、過程保持一致，保留湯劑整體、協同的療效優勢。