酸棗仁多組分鼻用溫敏凝膠的制備、評(píng)價(jià)及其聯(lián)合釋放研究

王黎　趙寧　李欣　徐啟萌　馬莉　王丹

摘要：以泊洛沙姆P407和泊洛沙姆P188為凝膠材料，甘油或聚乙二醇為保濕劑，制備了復(fù)方添加酸棗仁中主要有效成分酸棗仁皂苷a、酸棗仁皂苷b、斯皮諾素的復(fù)方多組分鼻用溫敏凝膠。以無(wú)膜溶出法進(jìn)行了凝膠體外釋放評(píng)價(jià)，以滲透膜法考察了其活性成分的聯(lián)合釋放規(guī)律，通過(guò)f2檢驗(yàn)法證實(shí)凝膠活性成為的體外釋放行為具有協(xié)同性。

關(guān)鍵詞：溫敏凝膠；酸棗仁；多組分；聯(lián)合釋放

中圖分類(lèi)號(hào)：TQ 460.6；R944.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1671-0460（2017）01-0004-04

酸棗仁（semen Ziziphi Spinosae）屬“藥食同源”藥材，其作用明確、安全性好，具有廣泛的應(yīng)用前景。其主要用途是中樞鎮(zhèn)靜，鼻腔給藥是一種具有腦靶向的給藥途徑，適用于酸棗仁制劑的給藥形式。鼻用溫敏凝膠劑在體外以溶液狀態(tài)存在，滴入鼻腔后，其在體溫的作用下發(fā)生相轉(zhuǎn)變，由液相轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂猩镳じ叫缘哪z，具有鼻腔滯留時(shí)間長(zhǎng)、中樞生物利用度高、胃腸道負(fù)擔(dān)小等特點(diǎn)。

“多組分、多靶點(diǎn)”是中藥的理論精髓和發(fā)展前沿嗍。運(yùn)用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)手段，以“多組分、多靶點(diǎn)”為理念，將成為我國(guó)未來(lái)中藥開(kāi)發(fā)的重要趨勢(shì)。本文課題組開(kāi)發(fā)了酸棗仁皂苷鼻用溫敏凝膠，取得了良好的效果，但酸棗仁的安神鎮(zhèn)靜作用主要是酸棗仁皂苷a、酸棗仁皂苷b及斯皮諾素協(xié)同作用的結(jié)果，有必要結(jié)合現(xiàn)代制藥技術(shù)開(kāi)發(fā)多組分酸棗仁制劑。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器

集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（DF-10S型，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；精密電子天平（92SM-202A-DRSCS型，PRECICA公司）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（DHG9140型，上海安亭科學(xué)儀器有限公司）；高效液相色譜儀（P680型，美國(guó)戴安公司）。

1.2 試藥

酸棗仁皂苷a、酸棗仁皂苷b、斯皮諾素（百靈威科技）；泊洛沙姆407、泊洛沙姆188（德國(guó)BASF公司）；PEG400（天津市福晨化學(xué)試劑廠(chǎng)）；甘油（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司）；丙二醇（天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；尼泊金乙酯（河南佳航化工產(chǎn)品有限公司）；磷酸鹽緩沖溶液自制；色譜乙腈（廣東光華科技股份有限公司），磷酸二氫鉀（西安化學(xué)試劑廠(chǎng)），氫氧化鈉（天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開(kāi)發(fā)有限公司），乙二胺四乙酸二鈉（天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司），無(wú)水碳酸鈉（天津市化學(xué)試劑三廠(chǎng)）；純凈水（成都娃哈哈昌盛飲料有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC測(cè)定方法的建立

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Agilentcl8柱（150mm×4.6mm×5μm）；流速：1.0mL/min；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：20μL。

（1）測(cè)定斯皮諾素：流動(dòng)相：乙腈-0.1%冰醋酸溶液，（20：80）；檢測(cè)波長(zhǎng)：335nm。

（2）測(cè)定酸棗仁皂苷a、酸棗仁皂苷b：流動(dòng)相：乙腈-水（32：68）；檢測(cè)波長(zhǎng)：204mm。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱(chēng)取酸棗仁皂苷a標(biāo)準(zhǔn)品20.0mg、酸棗仁皂苷b標(biāo)準(zhǔn)品20.0mg、斯皮諾素標(biāo)準(zhǔn)品20.0mg，置25mL容量瓶，加甲醇溶解并稀釋至刻度，即得濃度為0.8mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。臨用時(shí)精密量取上述3種溶液各2mL，酸棗仁皂苷a、b同置于一個(gè)10mL容量瓶，斯皮諾素置于另-10mL容量瓶，分別加甲醇溶解并稀釋至刻度，即得濃度均為0.16mg/mL的酸棗仁皂苷a、b混合對(duì)照品溶液及斯皮諾素對(duì)照品溶液。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制

精密量取上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，用流動(dòng)相分別稀釋成0.008、0.016、0.08、0.4、0.8mg/mL的供試液。0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，分別按2.1.1下的色譜條件操作，測(cè)定酸棗仁皂苷a的峰面積，以峰面積對(duì)濃度進(jìn)行回歸，得到方程Y=33.347X-1.6192，R=0.9996；同法測(cè)得酸棗仁皂苷b回歸方程Y=46.894X-0.6868，R=0.9993；測(cè)得斯皮諾素回歸方程Y=479.76X+11.233，R=0.9991，均呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.2 多組分溫敏型鼻用凝膠制備

2.2.1 人工鼻液的制備

取0.2mol/L磷酸二氫鉀溶液250mL，加0.2mol/L氫氧化鈉溶液118mL，用水稀釋至1000mL，搖勻，即得。

2.2.2 多組分溫敏型鼻用凝膠的制備

稱(chēng)取P1883g、P4079g，人工鼻液32.5g，保濕劑（甘油或聚乙二醇）3g，磁力攪拌使其分散均勻，于4℃冰箱放置24h，充分溶脹形成澄清透明溶液，即得空白泊洛沙姆溶液。攪拌下在空白泊洛沙姆溶液中加入酸棗仁皂苷a100mg、酸棗仁皂苷b50mg及斯皮諾素50mg，加入4mg尼泊金乙酯作為防腐劑。混勻后即得多組分溫敏型鼻用凝膠。

2.3 無(wú)膜溶出法試驗(yàn)

精密稱(chēng)取凝膠溶液2mL置5mL試管中，34℃放置10min待其完全膠凝。精密量取人工鼻液1mL加入試管中后精密稱(chēng)取試管總重。由于鼻腔溫度約為34℃，因此恒溫加熱磁力攪拌器設(shè)置溫度為34℃，并且以50r/min的頻率往復(fù)振蕩，分別于30、60、90、120、150、180min將上清液傾出，傾出時(shí)應(yīng)保持凝膠不被破壞，傾出后重新加入pH=6.8的磷酸緩沖液1mL后擦干表面精密稱(chēng)量，前后兩次質(zhì)量之差即為溶蝕量，計(jì)算累計(jì)溶蝕量及累計(jì)溶蝕率。樣液用水系0.45μm濾頭過(guò)濾，以2.1.1下的色譜條件操作，計(jì)算酸棗仁皂苷a的累積釋放率。重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)3次，計(jì)算平均累計(jì)溶蝕百分率及平均釋放百分率，見(jiàn)表1、表2，圖1-圖4。

2.5 斯皮諾素與酸棗仁皂苷的釋放曲線(xiàn)間相似度考察

酸棗仁皂苷a、b與斯皮諾素在本復(fù)方制劑中有協(xié)同促進(jìn)作用，但它們?cè)诒丘つど系娜艹鲠尫潘俾适芷淙芙舛鹊挠绊懴嗖钶^大。黃海英等測(cè)定了斯皮諾素的油水分配系數(shù)，發(fā)現(xiàn)其logP小于1，是一個(gè)較親水性的化合物。因此，不適宜的制劑方式將導(dǎo)致不同組分間釋放曲線(xiàn)形成顯著差異，影響協(xié)同藥效。有必要尋找適宜的制劑方式，使得這些組分在鼻粘膜處聯(lián)合釋放時(shí)，形成相似的釋放曲線(xiàn)，從而協(xié)同起效。

f₂檢驗(yàn)法是美國(guó)FDA頒布的評(píng)價(jià)不同釋放曲線(xiàn)相似程度的重要方法，在協(xié)同釋放、仿制藥一致性評(píng)價(jià)等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。

本文采用f₂檢驗(yàn)法考察了酸棗仁皂苷與斯皮諾素的釋放行為的協(xié)同性，其公式為f₂=50·log（[1+（1/n）∑_t=1ⁿ（R_t-T_t）²]^-0.5·100）。公式中R_t和T_t分別為各取樣時(shí)間點(diǎn)酸棗仁皂苷與斯皮諾素的累積溶出率，n為取樣點(diǎn)個(gè)數(shù)。公式計(jì)算結(jié)果f₂>50時(shí)，表示兩個(gè)釋放曲線(xiàn)較一致，兩者的釋放具有一致性。

將酸棗仁皂苷a、b與斯皮諾素的釋放曲線(xiàn)通過(guò)f₂檢驗(yàn)的方式考察其兩兩之間的釋放曲線(xiàn)相似性，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.4 透析袋法考察多組分聯(lián)合釋放情況

將透析袋剪成10至20cm小段，用配制好1mmol/L的EDTA-2Na溶液煮沸10min，最后用純凈水進(jìn)行漂洗。精密量取酸棗仁皂苷溫敏凝膠2mL置透析袋內(nèi)，34℃放置10min待其完全膠凝。放入含有120mL磷酸緩沖液pH=6.8的燒杯中。兩頭扎緊并留一部分空氣后將透析袋完全浸沒(méi)在溶液內(nèi)。水溫控制為34℃，轉(zhuǎn)速50r/min。分別于0.5h及此后每小時(shí)取一次樣，直至8h。取樣時(shí)用注射器取樣2mL于試管內(nèi)，且每次在燒杯內(nèi)補(bǔ)加同溫等量的緩沖液。將所得的樣品經(jīng)0.45μm的微孔濾膜過(guò)濾，分別以2.1.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定酸棗仁皂苷a、b與斯皮諾素的量，計(jì)算繪制其釋放曲線(xiàn)，如圖5所示。

表3表明，本文中所考察的酸棗仁中多組分鼻腔原位凝膠中的酸棗仁皂苷a、b的體外釋放曲線(xiàn)間f2檢驗(yàn)結(jié)果大于50，意味著酸棗仁皂苷a、b的體外釋放行為基本一致，具有良好的協(xié)同效應(yīng)；酸棗仁皂苷族與斯皮諾素間的f₂檢驗(yàn)結(jié)果在25至50之間，說(shuō)明斯皮諾素與酸棗仁皂苷族雖不屬于一致性釋放，但仍具有一定的協(xié)同釋放作用。

3 討論

中藥鼻腔給藥制劑在我國(guó)已有悠久的歷史，我國(guó)古代就有通過(guò)鼻腔給藥治療中風(fēng)、昏厥等癥的記載。鼻黏膜在解剖生理上與腦部存在著獨(dú)特的聯(lián)系，藥物經(jīng)鼻黏膜吸收后可通過(guò)鼻腔嗅上皮的雙極嗅細(xì)胞沿嗅神經(jīng)入腦，發(fā)揮中樞治療作用。因此，鼻腔給藥可以提高藥物在腦內(nèi)的濃度，有腦靶向的作用，可有效提高藥物生物利用度，且吸收迅速、起效陜、無(wú)損傷性、使用方便。

本文制備的酸棗仁溫敏凝膠制劑，膠凝溫度適宜，制備工藝簡(jiǎn)單，給藥方便，可直接滴入鼻腔，在鼻腔的生理溫度下轉(zhuǎn)變成凝膠，促進(jìn)藥物通過(guò)鼻腔吸收進(jìn)而進(jìn)入中樞發(fā)揮治療作用，增加療效。同時(shí)由于凝膠的生物粘附性，可大大增加藥物在鼻腔的滯留時(shí)間，從而持續(xù)提高患者的治療效果，還可降低使用傳統(tǒng)湯劑時(shí)的較大給藥劑量，降低患者的胃腸道及排尿負(fù)擔(dān)，具有一定的應(yīng)用及開(kāi)發(fā)前景。

多組分中藥的協(xié)同釋放問(wèn)題是目前中藥制劑的研究熱點(diǎn)與前沿。傳統(tǒng)的酸棗仁湯劑中，上述組分在熬制過(guò)程中已經(jīng)溶出，進(jìn)入體內(nèi)后各組分同時(shí)到達(dá)吸收部位，多組分、多靶點(diǎn)同時(shí)協(xié)同起效。因此，在這種新型多組分中藥制劑的研究過(guò)程中，有必要使其聯(lián)合釋放過(guò)程模擬傳統(tǒng)中藥特點(diǎn)，盡量使釋放的速率、過(guò)程保持一致，保留湯劑整體、協(xié)同的療效優(yōu)勢(shì)。