超高效液相色譜-串聯質譜法聯合衍生化測定大鼠腦透析液中多巴胺和5-羥基色胺

盧金蓮，胡維民，曹衛群，陶怡*，張旭敏

（1.上海藥明康德新藥開發有限公司生物分析部，上海200131；2.復旦大學生命科學學院，上海200433）

超高效液相色譜-串聯質譜法聯合衍生化測定大鼠腦透析液中多巴胺和5-羥基色胺

盧金蓮1，2，胡維民1，曹衛群1，陶怡1*，張旭敏2

（1.上海藥明康德新藥開發有限公司生物分析部，上海200131；2.復旦大學生命科學學院，上海200433）

本文建立超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）結合衍生化的方法，并快速測定大鼠腦組織微透液中多巴胺（DA）和5-羥基色胺（5-HT）的濃度。采用苯甲酰氯衍生化的方法進行透析液樣品預處理。在2.3min分析時間內，各組分得到很好的分離。使用10μL透析液樣品，DA和5-HT的定量下限可分別達到10pg/mL和5pg/mL，DA的線性范圍為10～5 000pg/mL，5-HT的線性范圍為5～2 500pg/mL，決定系數（R2）大于0.99。通過對質量控制樣品的分析，該方法的靈敏度和精密度得到了驗證。此方法可以成功地應用于微透析研究這兩種神經遞質的基礎水平檢測。

多巴胺；5-羥基色胺；微透析；神經遞質；液質聯用

微透析技術（Microdialysis）是一種可以從清醒活體獲取細胞間隙 液的取樣技術，其可以實時動態檢測目標組織中生物化學物質含量的變化。同時，其是一種微創的采樣技術，幾乎可以被用于連續測量任何組織的細胞外液中游離及結合分析物的濃度[1]。其能監測完整細胞外液物質（包括內源性和外源性）的動態變化，是目前在生理和病理情況下，研究活體藥物腦內分布、藥物透過血腦屏障情況及監測腦內藥物有效活性物質和神經遞質變化的方法[2，3]。微透析技術已日益成為藥物腦部研究的重要工具[4-8]。

神經遞質廣泛分布于哺乳動物的中樞神經系統、腦組織和體液中，其痕量測定對神經生理學、運動生理學、病理學、臨床醫學及疾病診斷等具有重要意義。阿爾茲海默病、帕金森、亨丁頓舞蹈癥皆為神經系統疾病且都與單胺類神經遞質水平異常有關[9]。因此，在新藥研發過程中，能夠快速、準確地監測給藥前后，腦透析液中此類神經遞質的水平變化，對新藥的篩選、評價有非常重要的意義。

腦透析液的樣品一般具有以下幾個特點：①腦組織細胞間質中大多數神經遞質的濃度都非常低；②樣品量非常有限；③使用的灌注液中含有的無機離子可能會影響神經遞質的定量分析[10]。因而，微透析技術需與分離效果好、定量準確、靈敏度高的分析方法相結合，才能在樣品量有限的前提下檢測到腦透析液中痕量的神經遞質。由此可見，建立一種靈敏度、重現性、分離度好的分析方法，是微透析研究成功的關鍵因素。分析方法一旦建立，還可以應用于血漿、尿液、組織等其他生物樣品中神經遞質的測定。

由于單胺類神經遞質的濃度低于其他類神經遞質（pmol/L級），所以其分析難度遠高于其他類神經遞質，缺乏快速高效的樣品前處理方法和高靈敏的檢測手段仍是目前深入開展研究的瓶頸[11]。目前檢測單胺類神經遞質的方法主要有分光光度法、化學發光法、化學熒光法、液相色譜法、電化學法和毛細管電泳法等[12，13]。前兩種方法由于靈敏度的限制，很少應用于微透析樣品檢測。高效液相色譜法與熒光法、電化學檢測法、質譜法的聯用是目前比較常用的分析方法[14-18]。高效液相色譜與熒光光譜法聯用，靈敏度高，選擇性好，線性范圍較寬，受外界條件的影響較小。但并不是所有的目標檢測物在相同的條件下都能發生熒光，因而其應用范圍較窄，在進行定量分析時，同時需要排除背景熒光和猝滅效應等的影響，并且需要確保作為流動相的溶劑在選擇的激發光照射下不會發射熒光，否則不能進行梯度洗脫。此外，高效液相色譜與熒光法聯用往往需要較長的分析時間（10～60min），且需要對樣品進行前處理[15-17]。電化學檢測法優點是靈敏度高、選擇性好，可測定大量非電活性物質中極痕量的電活性物質、線性范圍寬，但不能同時檢測多個神經遞質，電極有被污染的風險，而且有時候會出現干擾峰，干擾目標分析物的定量[12，18-19]。與其他技術相比，液相色譜-質譜聯用技術是目前普遍適用于與微透析結合進行分離、分析的技術。超高效液相色譜能顯著改善色譜峰的分離度和檢測靈敏度，同時大大縮短分析周期，因此特別適用于微量復雜混合物的分離和高通量研究[20-22]。

目前，運用液相色譜-質譜聯用方法檢測腦透析液中單胺類的神經遞質多巴胺（DA）和5-羥基色胺（5-HT）主要有以下難點：①為了改善相對回收率，微透析經常采用較低的流速（0.5～5.0μL/min），因此微透析技術常承受著樣品量低的困擾[3]；②細胞間質中大多數神經遞質的濃度都非常低，特別是單胺類神經遞質，所以要求非常低的定量下限；③待測物在質譜上的響應較低，而且極性大，在反相色譜上難保留。本文針對這些難點，用化學衍生化結合反相超高效液相色譜-串聯質譜法，建立了一種簡單、快速、易操作的檢測方法，同時檢測DA和5-HT。

1 試驗部分

1.1 儀器和試劑

AB SCⅠEX QTRAP 6500+質譜（AB SCⅠEX）；ACQUⅠTY UPLC 超高壓液相和自動進樣器（Waters）；Milli-Q 超純水凈化器（Millipore）；微型渦旋混合儀（上海汾西分析儀器廠）；多管混勻儀（Fisher Scientific）；1.5mL離心管（Eppendorf）；96孔進樣板（Corelle Life Science Co.Ltd.）。

乙腈，甲醇（色譜純，Merck）；人工腦脊液（Artificial CSF）（Harvard apparatus）；苯甲酰氯，純度≥99%（Sigma-Aldrich）；四硼酸鈉，純度99.5%（Alfa Aesar）。

1.2 標準品及內標

鹽酸多巴胺（DA）、5-羥基色胺鹽酸鹽（5-HT）純度分別99.9%和99%，購買于Sigma Aldrich；同位素內標2-(3,4-Dihydroxyphenyl) ethyl-1,1,2,2-d4-amine HCl (d4-DA)、Serotonin-α,α,β,β-d4 Creatinine Sulfate Complex (d4-5-HT)購買于C/D/NⅠsotopes Ⅰnc.。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品衍生化方法

四硼酸鈉粉末稱重后，配制100mM水溶液備用，加熱后溶解。取10μL透析液樣品加入1.5mL離心管中，然后依次加入25μL四硼酸鈉水溶液和25μL2%苯甲酰氯乙腈溶液，搖勻之后室溫震蕩30min，反應完成，將樣品轉移至96孔進板，準備進樣。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：ACQUⅠTY UPLC? BEH C18 2.1mm×50mm Ⅰ.D.，1.7μm（Waters）；柱溫55℃，流速0.6mL/min，進樣量15μL；流動相A，0.025%甲酸和1mmol/L乙酸銨在5%乙腈溶液中；流動相B，0.025%甲酸和1mmol/L乙酸銨在95%乙腈溶液中；洗脫梯度如表1所示。

表1 液相洗脫梯度

1.3.3 質譜條件

電離模式，電噴霧離子化；離子源，渦輪噴霧；霧化氣，65psi；輔助加熱氣，65psi；氣簾氣，40psi； 噴霧電壓5500V；離子源溫度500℃；掃描模式，正離子多反應離子監測，參數如表2所示。

表2 多巴胺，5-羥基色胺及同位素內標的母離子，子離子，碰撞能量和保留時間

1.3.4 數據采集和處理

化合物和內標的保留時間、色譜圖采集和色譜圖的積分及數據的統計由軟件Analyst（Applied Biosystems，版本號1.6.3，Foster City，CA，USA）進行處理。校正曲線以1/x2為加權系，用峰面積比值（分析物/內標）對校正標樣中DA和5-HT的濃度進行線性回歸。

1.3.5 校正曲線和質控樣品的配制

稱量DA和5-HT的標準品，分別用20%乙腈溶液溶解成1mg/mL的標準品儲備液，存儲于-80℃冰箱備用。

分別量取DA和5-HT的標準品儲備液（1mg/mL在20%乙腈/水溶液中），用20%乙腈稀釋到10μg/mL和5μg/mL作為儲備液1；然后繼續稀釋20倍，得到200ng/mL和100ng/mL的儲備液2；最后，用人工腦脊液稀釋成DA濃度范圍為10～5 000pg/mL，5-HT濃度范圍為5～2 500pg/mL的校正曲線。質控樣品用相同的方式配制成定量下限、低、中和高4個濃度。

2 結論和討論

2.1 衍生化反應路徑

DA和5-HT的結構中都有氨基，可以與醛、酮反應或與酰鹵反應來衍生化[23，24]。與醛、酮反應相對與酰鹵反應來說反應條件較復雜，通常需要較長的反應時間或者嚴格的pH控制。本文采用苯甲酰氯作為衍生化試劑，對DA和5-HT進行羥基和氨基的酰化反應。例如，苯甲酰氯可以與DA的氨基及2個酚羥基發生反應，共3個分子的苯甲酰氯結合在DA上，衍生化的結合位點及路徑如圖1所示。

圖1 多巴胺衍生化路徑

2.2 線性范圍

大鼠腦部微透析的動物試驗是將灌注液（Artificial CSF）通過探針灌注到目標位置，由于灌注液的稀釋，微透析樣品中神經遞質的濃度要低于在大腦中的濃度。因此，微透析樣品中神經遞質的檢測限越低越好。該試驗中，DA的線性范圍為10～5 000pg/mL，校準曲線的濃度設置由低到高分別是10、20、50、250、500、2 500、4 250pg/mL和5 000pg/mL；5-HT的線性范圍為5～2 500pg/mL，校準曲線的濃度設置有低到高分別是5、10、25、125、250、150、2 125pg/mL和2 500pg/mL。標準曲線采用線性回歸，DA和5-HT的校正曲線決定系數（R2）分別0.995 2和0.999 5。

2.3 分析方法靈敏度

DA和5-HT的定量下限具有良好的信噪比和靈敏度。在人工腦脊液中的定量下限分別是10pg/mL和5pg/mL，DA和5-HT的定量下限色譜峰如圖2所示。

圖2 DA和5-HT的定量下限色譜峰

2.4 準確度和精密度

準確度和精密度通過定量下限、低、中、高4個濃度，每個質控樣品濃度水平6個測定值來評價以考察方法的準確性和精密度，DA的4個質控樣品濃度分別為10、30、1 500、4 000pg/mL，平均的準確度為98.6%～107.7%，變異系數為1%～13%；5-HT的4個質控樣品濃度分別為5、15、750、2 000pg/mL，平均的準確度為95.8%～111.8%，變異系數為2%～5%。

2.5 實際樣品檢測

利用微透析技術采集腦部透析液，每隔20min采集一次，在40min處大鼠給藥安非他命（Amphetamine）2mg/kg，得到的安非他命，在給藥前后腦透析液中DA和5-HT的濃度變化情況如圖3所示。結果顯示，本方法能夠檢測大鼠在給藥前腦部透析液中DA和5-HT的基礎水平，以及給藥之后透析液中DA和5-HT隨時間的變化情況。由此說明，本方法靈敏度高，可滿足大鼠腦微透析試驗的樣品檢測。

圖3 安非他命及多巴胺和5羥基色胺在給藥安非他命前后在大鼠腦透析液中的變化

3 結論

本文成功開發了超高壓液相-串聯質譜結合衍生化檢測人工腦脊液中DA和5-HT的方法，本方法的優點是：①定量下限低，完全滿足微透析樣品檢測需求，可以檢測到透析液樣品中DA和5-HT的基礎水平；②操作簡單，衍生化方法簡單、快速、易操作、重現性好，反應僅需30min，可進行批量樣品處理；③UPLC-MS/MS 方法快速，僅2.3min即可達到很好的分離效果，并且通過衍生化處理，改善了DA和5-HT在反相色譜上的保留，尤其顯著提高了質譜響應；④本方法檢測限低，線性范圍良好，同時具有較好的準確性和精密度。

此方法不僅可用于大鼠腦微透析樣品檢測，前處理方法稍加改變即可應用于其他生物基質的樣品檢測。

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Simultaneous Quantification of Dopamine and 5-hydroxytryptaphane in Rat Brain Dialysate by Ultra Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry

Lu Jin-lian1,2,Hu Wei-min1,Cao Wei-qun1,Tao Yi1*,Zhang Xu-min2
(1.Non-GLP BAS,WuXiAppTec,Shanghai 200131;2.School of Science,Fudan University,Shanghai 200433)

In this paper,a method was developed for the combination of ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) and derivatization,to determine the concentration of dopamine (DA) and 5-hydroxytryptaphane (5-HT) in the rat brain dialysates.Benzoyl chloride was used as derivatization reagent.The components were well separated in the 2.3min.Using 10 μL dialysate samples,the lower limit of DA and 5-HT could reach 10 pg/mL and 5 pg/mL respectively,the linear range of DA was from 10 to 5 000 pg/mL,the linear range of 5-HT was from 5 to 2 500 pg/mL,and the determination coefficient (R2) was greater than 0.99.The sensitivity and precision of the method were verified by the analysis of the quality control samples.This method can be successfully applied to the microdialysis study of the basal level detection of both the neurotransmitters.

Dopamine;5-hydroxytryptaphane;Microdialysis;Neurotransmitter;Liquid chromatography-mass spectrometry

R446.1；O657.63

A

2096-0387（2017）03-0035-05

盧金蓮（1987-），女，遼寧丹東人，碩士在讀，研究方向：生物樣本定量分析。

陶怡（1974-），女，河北天津人，博士，研究方向：生物分析。