松針中游離氨基酸代謝對環境氮的響應

胡居吾，朱仁果*，王慧賓，鄧朝陽，張蕾

（1.江西省科學院應用化學研究所，江西南昌330096；2.山西省實驗中學，山西太原030200）

松針中游離氨基酸代謝對環境氮的響應

胡居吾1，朱仁果1*，王慧賓1，鄧朝陽1，張蕾2

（1.江西省科學院應用化學研究所，江西南昌330096；2.山西省實驗中學，山西太原030200）

通過分析貴州省貴陽市區雪松松針組織中總游離氨基酸含量和氨基酸單體含量變化，發現貴陽市雪松針葉組織的總游離氨基酸含量從貴陽市遠郊到交通主干道呈上升趨勢，從遠郊的484.5μg/g增加到交通主干道的2 449.6μg/g，該變化趨勢與總氮變化一致，但針葉中總游離氨基酸含量的變化范圍（增加了5.1倍）要大于針葉中總氮含量變化范圍（增加了1.6倍）。該結果表明松針中的游離氨基酸也能用于指示環境氮含量的變化，且對環境氮的響應比植物總氮更靈敏。貴陽市區雪松針葉中20種游離氨基酸的含量都隨著組織總氮含量的增加而增加。其中，以脯氨酸（Pro）和賴氨酸（Lys）含量的增加最為顯著，分別增加了25倍和30倍。當組織總氮增加時，每種氨基酸占總氨基酸的比例會發生變化。其中，脯氨酸（Pro）、精氨酸（Arg）增加的比例最多，Pro占總游離氨基酸的比例從3%增加15%，Arg占總游離氨基酸的比例從8%增加13%；而谷氨酸（Glu）占總氨基酸的比例減少最多從37%下降到23%，表明環境氮含量增加時，多余的含氮會通過合成特定的低C/N比游離氨基酸來消解。

環境氮；松針；貴陽市

近年來增加的氮沉降使得一些原本氮缺乏的生態系統有著過多的氮供給。當氮沉降超過了生態系統氮的保留能力時將會導致氮飽和。氮飽和會給植物帶來一系列的影響，比如礦物的不平衡（必須礦物Mg、K、P相對于N的缺乏）[1]，針葉發黃[2]，菌根數量減少[3]，甚至會使得森林退化和生物多樣性減少[4]。

在過量氮沉降引起某種植物種類和數量大量變化之前，植物自身的新陳代謝會對高的氮輸入作出響應，如葉子氮濃度的增加[4，5]和游離氨基酸的累積[3]。這些植物組織內新陳代謝的變化可以用于指示該植物種、采樣點或是生態系統是否受到了過量氮沉降的影響。

已有研究表明植物葉片中的含氮化合物（非蛋白氮和溶解性氨基酸）可以用于指示植物組織中早期的氮積累[3]。對松針[6]、森林下層林木[7]、歐石楠植物[5]、側生萌苔蘚組織[8]中游離氨基酸的研究，都發現了植物組織中游離氨基酸對大氣氮沉降的響應。但是，目前對植物中特定游離氨基酸單體對環境氮響應的研究還較少。

本研究通過分析貴州省貴陽市區雪松松針組織中游離氨基酸含量的變化，揭示環境氮沉降變化對植物氨基酸代謝可能產生的影響，探討特定氨基酸對環境氮的響應差異，以及利用游離氨基酸含量變化示蹤環境氮含量變化的可行性。

1 材料與方法

1.1 研究區域狀況

貴州省貴陽市是我國西南喀斯特地區的一個省會城市。貴陽市大氣氮沉降的主要特征是氨濃度高，氮氧化物的濃度較低。隨著經濟的發展，貴陽市氮氧化物的排放量呈上升趨勢，見表1。從表1可見，2011年氮氧化物排放總量為55.32萬t，比2010年增加12.24%。

表1 貴州省貴陽市近年來氮氧化物的排放量

1.2 試樣的采集和處理方法

于2012年3月在貴陽市遠郊、公園、市中心和交通干道采集雪松樣品。采樣點開闊不受建筑物等遮擋。所有采集的松樹沒有明顯損傷。松針枝條位于樹的北面或是東北面以避免可能的光照對氨基酸濃度的影響。所有樣品用干凈塑料自封袋保存，迅速放入冰盒，帶回實驗室冰箱-20℃冷凍保存備用。

1.3 實驗儀器

ST16高速離心機，美國Thermo公司；Essential 5 Millipore純水機，美國Millipore公司；BS210S分析天平，德國Sartorius公司；SL-200小型萬能粉碎機，杭州三思儀器公司；PHS-2C數顯恒溫水浴鍋，江蘇金壇市醫療器械；Agilent 6890氣相色譜儀，美國安捷倫公司。

1.4 游離氨基酸的提取和測定方法

將采集樣品冷凍干燥后，準確稱取200mg樣品。用10mL 90℃超純水提取30min，待冷卻后離心（1萬轉；45min）取上清液過0.22μm濾膜，再用10mL超純水超聲波復提30min后離心（1萬轉；45min），取上清液過0.22μm濾膜。將2次過濾后的上清液混合于-20℃條件下保存。

游離氨基酸含量的測定參照Jiménez-Martín（2012）的方法[9]。用硅烷化衍生方法（MTBSTFA）將19種蛋白質氨基酸和1種非蛋白質氨基酸（GABA）衍生成其相對應的N（O）-叔丁基二甲基硅烷氨基酸衍生物后用氣相色譜（Agilent 6890，美國）測定氨基酸含量。分析時的測試條件是：色譜柱為DB-5MS（30m×0.25mm×0.25μm）；載氣為氦氣；恒流模式為流速1.2mL/min；進樣口溫度270℃；采用三階段程序：90℃保留1min，8℃/min升到140℃，保留5min，3℃/min升到220℃，12℃/min升到285℃保持12.5min。

2 結果與討論

2.1 不同氮沉降下針葉中總游離氨基酸含量變化

本文分析了貴陽市4個采樣點雪松針葉中總游離氨基酸的變化以及占總氮的比例，結果如圖1所示。

圖1 貴州省貴陽市雪松針葉總氨基酸含量和總氮含量的變化

從圖1可見，貴陽市雪松針葉組織的總氮含量從貴陽市遠郊到交通主干道增加，變化范圍為1.6%～2.7%。相應的針葉組織中的總游離氨酸含量也呈上升趨勢，從郊區的484.5μg/g增加到交通主干道的2 449.6μg/g。針葉中總游離氨基酸含量的變化（增加了5.1倍）要大于針葉中總氮含量變化（增加了1.6倍）。

2.2 不同氮沉降下針葉中總游離氨基酸占總氮的比例變化

通過分析市區4個采樣點雪松針葉中游離氨基酸占總氮的比例發現，隨著雪松針葉中總氮含量增加，針葉組織中游離氨基酸會也相應增加，并且當組織總氮到達某一閾值時，針葉中游離氨基酸會發生顯著的累積。郊區雪松針葉組織中總游離氨基酸含量占總氮含量的2.7%，而在市區交通主干道上這個比例上升到了9.8%。雪松針葉的總氮含量增加小于19mg/g時，總游離氨基酸占總氮的百分比變化不大，占松針總氮的比例小于3.5%。當雪松針葉中的總氮含量大于19mg/g時，總游離氨基酸占總氮的百分比明顯增大，占總氮的比例大于7%（見圖2）。

圖2 貴陽市總氨基酸占總氮含量的百分比

2.3 雪松針葉中20種游離氨基酸含量分析

貴陽市區雪松針葉中20種游離氨基酸的含量都隨著組織總氮含量的增加而增加。其中，以脯氨酸（Pro）和賴氨酸（Lys）含量的增加最為顯著，分別增加了25倍和30倍。其他含量顯著增加的氨基酸還有異亮氨酸（Ⅰle）、天冬酰胺（Asn）、精氨酸（Arg）、組氨酸（His）。松針中Ⅰle、Asn含量增加了9倍，Arg含量增加了8倍，His含量增加了6倍（見圖3）。

圖3 市區松針組織中20種氨基酸含量

2.4 雪松針葉中20種游離氨基酸占總氨基酸含量比例變化

雪松針葉組織總氮含量增加時，20種游離氨基酸增加幅度并不相同，當組織總氮增加時，每種氨基酸占總氨基酸的比例會發生變化。丙氨酸（Ala）、纈氨酸（Val）、異亮氨酸（Ⅰle）、脯氨酸（Pro）、絲氨酸（Ser）、天冬氨酸（Asp）、天冬酰胺（Asn）、賴氨酸（Lys）、精氨酸（Arg）、組氨酸（His）和色氨酸（Trp）占總游離氨基酸比例增加，甘氨酸（Gly）、亮氨酸（Leu）、蛋氨酸（Met）、蘇氨酸（Thr）、苯丙氨酸（Phe）、谷氨酸（Glu）、谷氨酰胺（Gln）和酪氨酸（Tyr）占游離氨基酸比例減少。其中，Pro、Arg增加的比例最多，Pro占總游離氨基酸的比例從3%增加15%，Arg占總游離氨基酸的比例從8%增加13%；而Glu占總氨基酸的比例減少最多，從37%下降至23%（見圖4）。

圖4 20種氨基酸游離氨基酸占總氨基酸含量的比例

3 結論

貴陽市從遠郊到交通主干道松針組織中總游離氨基酸含量和總氮含量也有相似的變化規律，并且總游離氨基酸含量的變化范圍要大于植物總氮的變化，說明松針中的游離氨基酸對環境氮的響應比植物總氮更靈敏。

環境氮含量會改變植物的氮代謝機制，多余的含氮化合物會通過合成低的C/N比游離氨基酸來解毒。可以通過測定特定氨基酸含量變化來指示環境氮沉降。

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Free Amino Acids in Pine Needles Response to Environment Nitrogen

Hu Ju-wu1，Zhu Ren-guo1*，Wang Hui-bin1，Deng Zhao-yang1，Zhang lei2
(1.Institute of Applied Chemistry,Jiangxi Academy of Sciences,Jiangxi Nanchang 330029;2.Shanxi Experimental Secondary School,Shanxi Taiyuan 030200)

Total nitrogen content of cedar needles tissues increased from rural of Guiyang city of Guizhou province to the main traffic road ,corresponding total free amino acid content in the needles showed the same ascendant trend,increased from 484.5μg/g in the suburbs of Guiyang to 2 449.6 μg/g in traffic trunk road.Change trend of free amino acids content in needle was consistent with total nitrogen,and the changes of the content of free amino acid (5.1) were greater than the total nitrogen of needle tissues (1.6).The response of the free amino acid of needles to environment nitrogen was more sensitive than total nitrogen of the needle tissues.The content of twenty kinds of free amino acids of cedar pine increased by the total content of nitrogen of cedar pine in Guiyang city,but increased proportion of Twenty amino acids was different,which finally result proportion of amino acids in needle changed.Pro and Arg increased most significantly.Pro increased from 3% to 15%.Arg increased from 8% to 13%.Glu decreased from 37% to 23%.Higher doses of nitrogen or long term impacts in pine stands lead to changes in the detoxification mechanism.In order to avoid an accumulation of cytotoxic ammonia,assimilated nitrogen compounds must be detoxified by forming amino acids with available C-skeletons.

Environmental nitrogen;Pine needles;Guiyang City

X173

A

2096-0387（2017）03-0005-04

江西省自然科學基金（2014FBAB203021）。

胡居吾（1977-），男，博士在讀，副研究員，研究方向：天然產物化學。

朱仁果（1985-），博士，研究方向：天然產物化學。