大鼠部分肝切除后肝細胞生長因子激活因子抑制因子1，2的表達

席 銳，李曉濤，王 璐，王麗娟

大鼠部分肝切除后肝細胞生長因子激活因子抑制因子1，2的表達

席 銳，李曉濤，王 璐，王麗娟

目的探討肝細胞生長因子激活因子抑制因子（hepatocyte growth factor activator inhibitor, HAI）1、HAI-2在部分肝切除后的表達特點，分析HAI-1和HAI-2在肝再生中的作用。方法隨機將健康雄性SD大鼠分成對照組和肝切除組，各30只。在肝切除手術前和手術后3 h、12 h、24 h以及48 h時，對比2組HAI-1和HAI-2 mRNA和蛋白的表達變化。結果手術前2組HAI-1、HAI-2的 mRNA及蛋白均呈顯著低表達，組間無明顯差異（P＞0.05）；與手術前相比，術后對照組HAI-1、HAI-2的mRNA及蛋白均無明顯變化（P＞0.05）；而肝切除組HAI-1 mRNA和蛋白表達水平先顯著升高再逐漸下降，同時間點與對照組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；HAI-2 mRNA和蛋白則無明顯變化（P＞0.05）。結論HAI-1在部分肝切除肝細胞再生過程中呈持續高表達，其可能參與了肝細胞再生過程，而HAI-2對肝再生過程無明顯影響。

肝切除；肝再生；肝細胞生長因子激活因子抑制因子

肝細胞具有極強的再生能力，在肝臟發生損傷或切除后，肝細胞能夠立即啟動再生過程以滿足肝細胞功能代償性需要。因此，積極研究肝再生機制具有重要意義。現有研究表明肝細胞再生過程極為復雜，不僅與血管形成過程相關，而且與多種細胞因子水平具有密切關系[1]。肝細胞生長因子激活因子抑制因子（hepatocyte growth factor activator inhibitor, HAI）作為肝細胞生長因子激活因子（hepatocyte growth factor activation factor, HGFA）的抑制性因素[2-4]，被證實能夠影響基于惡性腫瘤、組織缺損情況下的肝細胞、組織生長分化過程[5-6]。本文通過觀察HAI-1和HAI-2在肝再生過程中的表達情況，旨在初步分析HAI對肝再生的影響效果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性清潔級別SD大鼠60只，體質量為180～210 g，周齡為10～12周，購自上海西普爾必凱實驗動物有限公司，滬檢證第SCXK2008 0002號。處理方法符合實驗動物處理原則[7]。

1.2 主要儀器和試劑 超低溫冰箱（德國Heraeus公司）；TGL高速離心機（中國上海離心機械研究所）；PCR定量擴增儀、Real-time PCR試劑（美國Applied Biosystems公司）；Trizol試劑、 RNA逆轉錄試劑等（美國Invitrogen公司）。

1.3 建立肝再生動物模型 將SD大鼠于常溫（25±2） ℃、恒濕（50%～60%）環境中喂養3 d，自由飲食和喂水，光暗接受比例為12 h∶12 h。適應性喂養后將大鼠隨機分成對照組和肝切除組，各30只。參照文獻[8]，將肝切除組大鼠切除部分肝組織（約70%）建立部分肝切除再生模型，具體方法如下：大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉，于腹部正中作一長2.0 cm切口，依次銳性分離進入腹腔，利用攝子將整個肝臟輕輕提起，完全切除肝臟中葉和左葉，剩余肝組織止血、沖洗、還納腹腔，確認無活動性出血后依次縫合切口，手術結束。對照組大鼠接受假手術，術中不切除任何組織。

1.3 檢測指標

1.3.1 組織獲取 對照組和肝切除組在手術前、手術后3 h、12 h、24 h以及48 h各時間段分別取6只SD大鼠，通過剖殺方式獲取全脾組織作為檢測標本。

1.3.2 RT-PCR 將對照組和肝切除組脾組織分別進行無菌研磨后，提取1.0 g組織作為檢測標本，添加細胞裂解溶液，經貼壁培養，DEPC處理，核蛋白復合物解離等處理后用Trizol溶液一步法提取脾組織RNA，添加氯仿并用手甩脫震蕩15 s后，在室溫下進行孵育，提取經過孵育的RNA 1.0 μg，利用AMV反轉錄酶提取cDNA（具體條件為42 ℃下15 min→95 ℃下5 min→4 ℃下終止反應5 min），將cDNA產物放置到-20 ℃冰箱中留存。利用Beacon designer軟件設計HAI-1和HAI-2的引物序列，由上海歌凡生物設計公司合成。完成引物合成、PCR反應液配置后將HAI-1和HAI-2反應液分別放置到96孔微孔板中，添加對應cDNA模板（5.0 μl），完成封膜后，將微孔板放置到定量PCR分析儀完成RT-PCR擴增反應，勾畫溶解曲線，讀取吸光值，雙標準曲線法計算目的基因mRNA相對表達量。

1.3.3 Western blot 分別取對照組和肝切除組脾組織1.0 g進行蛋白裂解和超聲勻漿，抽提細胞總蛋白，調整樣品蛋白濃度為2 μg/μl，配置分離膠和濃縮膠。提出1.0 μl樣品總蛋白量，添加2.0倍體積loading溶液，放置到沸水中煮5 min后冷卻放置到4 ℃冰箱中備用。將蛋白樣本緩慢加入到反應玻璃孔板中并做好標記，將樣品放置到配置好的電泳中進行電泳反應（上層80 V作用約20 min，下層120 V作用約40 min，待溴酚藍至分離膠底部為宜），完成電泳后，取下玻璃板進行常規切膠、PVDF轉膜、封閉后，添加一抗（即HAI-1抗體和HAI-2抗體，比例均為1∶10 000）并在4 ℃下孵育過夜，TBST洗滌后添加二抗孵育，制備ECL化學發光劑A和B等體積工作液，將印跡膜和工作液共同放置并孵育5 min后，吸除多余工作液和氣泡，將待測品轉移到暗室中拍攝X線片并進行顯影定影，通過圖像分析軟件進行分析，將待測品與β-actin積分光密度比作為相對蛋白表達量。

1.4 統計學處理 用CHISS 2004進行統計分析。計量資料呈正態分布，用±s表示。多組間比較用F檢驗（組間方差齊），多重比較用q檢驗。2組間比較用成組t檢驗（組間方差齊）。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 HAI-1 mRNA和HAI-2 mRNA表達變化 手術前2組SD大鼠的脾組織中均有HAI-1 mRNA和HAI-2 mRNA表達，但是2組均為低表達，且差異無統計學意義。

肝切除組HAI-1 mRNA術后3 h即顯著升高，12 h達峰值，然后開始逐漸下降，48 h下降到術后3 h水平，但術后各時間點均高于術前水平（P均＜0.05）。對照組HAI-1 mRNA水平術后各時間點無明顯上升，與術前保持在相同水平（P均＞0.05）。在術后各時間點，肝切除組HAI-1 mRNA均高于對照組（P均＜0.05）。見表1。2組術后HAI-2 mRNA均無明顯升高（P均＞0.05）。在術后各時間點，2組間HAI-2 mRNA差異亦無統計學意義。見表2。

表1 2組手術后不同時間點HAI-1 mRNA水平比較（±s）Table 1 Comparison of HAI-1 mRNA levels at different time points after operation in 2 groups(±s)

表1 2組手術后不同時間點HAI-1 mRNA水平比較（±s）Table 1 Comparison of HAI-1 mRNA levels at different time points after operation in 2 groups(±s)

注：a. 與手術前比較，P＜0.05； b. 與手術后3 h比較，P＜0.05；c. 與手術后12 h比較，P＜0.05；d. 與手術后24 h比較，P＜0.05

手術時間 肝切除組(n=6) 對照組(n=6) t值 P值手術前 8.554±0.315 8.548±0.325 0.032 0.975術后3 h 11.426±0.295a 8.534±0.266 17.834 0.000術后12 h 31.157±2.583ab 8.565±0.513 19.091 0.000術后24 h 18.425±2.809abc 8.545±0.153 8.603 0.000術后48 h 12.471±0.432acd 8.555±0.298 18.277 0.000 F值 147.964 0.007 P值 0.000 0.999

表2 2組手術后不同時間點HAI-2 mRNA水平比較（±s）Table 2 Comparison of HAI-2 mRNA levels at different time points after operation in 2 groups(±s)

表2 2組手術后不同時間點HAI-2 mRNA水平比較（±s）Table 2 Comparison of HAI-2 mRNA levels at different time points after operation in 2 groups(±s)

手術時間 肝切除組(n=6) 對照組(n=6) t值 P值手術前 1.098±0.276 1.095±0.253 0.020 0.984術后3 h 1.115±0.243 1.118±0.494 -0.013 0.990術后12 h 1.135±0.263 1.109±0.163 0.206 0.841術后24 h 1.128±0.215 1.113±0.232 0.116 0.910術后48 h 1.123±0.234 1.102±0.153 0.184 0.858 F值 0.020 0.006 P值 0.999 1.000

2.2 HAI-1蛋白和HAI-2蛋白表達變化 手術前2組SD大鼠的脾組織中均有HAI-1蛋白和HAI-2蛋白表達，但是2組均為低表達，且差異無統計學意義。

肝切除組術后HAI-1蛋白水平3 h即顯著升高，12 h達峰值，然后開始逐漸下降，但術后各時間點HAI-1蛋白水平均高于術前水平（P均＜0.05）。對照組術后各時間點無明顯上升，與術前保持在相同水平（P均＞0.05）。在術后各時間點，肝切除組HAI-1蛋白水平均高于對照組（P均＜0.05）。見表3。 2組術后HAI-2蛋白水平均無明顯升高（P均＞0.05）。在術后各時間點，2組間HAI-2蛋白水平差異亦無統計學意義。見表4。

表3 2組手術后不同時間點HAI-1蛋白水平比較（±s）Table 3 Comparison of HAI-1 protein levels at different time points after operation in 2 groups(±s)

表3 2組手術后不同時間點HAI-1蛋白水平比較（±s）Table 3 Comparison of HAI-1 protein levels at different time points after operation in 2 groups(±s)

注：a. 與手術前比較，P＜0.05；b. 與手術后3 h比較，P＜0.05；c. 與手術后12 h比較，P＜0.05；d. 與手術后24 h比較，P＜0.05

手術時間 肝切除組(n=6) 對照組(n=6) t值 P值手術前 8.565±0.315 8.553±0.324 0.065 0.949術后3 h 12.146±0.278a 8.586±0.268 22.583 0.000術后12 h 30.206±0.269ab 8.515±0.218 153.452 0.000術后24 h 17.253±0.298abc 8.542±0.396 43.054 0.000術后48 h 13.861±0.214abcd 8.565±0.355 31.296 0.000 F值 5422.784 0.041 P值 0.000 0.997

表4 2組手術后不同時間點HAI-2蛋白水平比較（±s）Table 4 Comparison of HAI-2 protein levels at different time points after operation in 2 groups(±s)

表4 2組手術后不同時間點HAI-2蛋白水平比較（±s）Table 4 Comparison of HAI-2 protein levels at different time points after operation in 2 groups(±s)

手術時間 肝切除組(n=6) 對照組(n=6) t值 P值手術前 1.096±0.254 1.083±0.265 0.087 0.933術后3 h 1.113±0.245 1.132±0.492 -0.085 0.934術后12 h 1.145±0.238 1.165±0.182 -0.164 0.873術后24 h 1.123±0.256 1.115±0.333 0.047 0.964術后48 h 1.085±0.268 1.084±0.278 0.006 0.995 F值 0.052 0.067 P值 0.995 0.991

3 討 論

在生理性條件下，肝細胞主要呈靜息狀態，但是在病理性肝損傷發生后，肝臟超強的代謝和再生能力就會被即刻激活。肝細胞的再生能力作為肝部分切除術、肝臟移植術治療的生理學基礎，一直是臨床研究的熱點。由于肝臟再生過程受到肝臟細胞、肝外器官、蛋白基因表達、轉錄因子激活等諸多因素影響[9-10]，目前關于肝再生機制仍有諸多難解之謎，一直是再生醫學中最受關注的熱點方向。由于倫理道德的限制，目前關于肝細胞再生性研究仍處于動物實驗水平。

HGFA作為調節肝細胞生長因子生物學活性的關鍵性因子，能夠通過活化前體肝細胞生長因子而促進肝組織再生，而一旦HGFA活性受到抑制，則肝再生過程將受到嚴重影響。HAI作為首次發現于胃癌中的HGFA表面抑制因子，隨著研究的不斷深入，國內外研究相繼發現其對于HGFA具有蓄積效應，能夠通過膜結合形式將HGFA進行定位和聚集，并且通過活化細胞周圍的生長因子活性而加快細胞生長增殖。目前有研究發現在腫瘤生長過程中HAI-1和HAI-2發揮了重要作用，但是截至目前關于肝再生過程中HAI的作用價值研究仍極為少見[11-12]。

鑒于目前已經證實在肝再生過程中主要為脾源性HAI表達[13]，且肝組織中HAI幾乎不表達，因此，本實驗在建立部分肝切除肝再生動物模型基礎上，以健康小鼠作為對照，旨在研究在肝再生過程中脾源性HAI-1和HAI-2的表達情況。經過實驗觀察發現，在手術前，SD大鼠體內脾源性HAI-1和HAI-2表達水平均較為低下，說明在正常情況下，動物體內脾源性HAI-1和HAI-2幾乎不表達。在手術后，對照組大鼠HAI-1和HAI-2表達水平沒有出現顯著改變，說明假手術雖然也屬于應激性反應，但是由于未對肝組織造成損失，因此對HAI-1和HAI-2表達并無明顯影響，間接證實了HAI-1和HAI-2表達可能僅在肝再生過程中發生明顯變化。進一步對2組SD大鼠HAI-1和HAI-2表達情況進行分析發現，在手術后，肝切除組HAI-2未出現明顯變化，而HAI-1先顯著上升到峰值后逐漸下降，說明在肝再生過程中HAI-2未發揮明顯影響，而HAI-1表達則與肝再生過程密切相關，同時直接證實了在肝切除后短期內肝再生即可啟動，且HAI-1能夠參與調節肝再生過程，HAI-2雖然與HAI-1具有同源性，但是并未參與肝再生過程，說明二者生物學作用仍存在一定差別。國內學者在實驗中通過對肝再生過程中HAI-1和HAI-2 mRNA表達水平進行分析也發現二者生物學作用存在相異之處[14-16]。HAI-1和HAI-2作為同源性代表因子，是目前研究最為廣泛的HAI家族成員，HAI-1作為Kunitz型抑制因子，能夠通過調節HGFA和Matriptase活性而調控HGF/ c-Met信號傳導通路，其表達水平能夠直接影響靶蛋白酶活性，從而對細胞生長增殖、組織損傷修復過程產生影響，其表達水平與肝再生過程中細胞生長周期、體內HGFA合成分泌出現匱乏、肝細胞生長因子活性明顯不足、肝再生活性間歇期等有關。HAI-2作為II型跨膜型抑制劑，對組織形態形成具有重要作用，但是對于靶蛋白酶活性無明顯干預作用，因此對肝細胞再生無明顯影響。由于實驗條件有限，對于HAI具體作用通路和機制研究仍不完全，且對于肝臟疾病對肝再生的影響未予納入，因此，關于HAI在肝再生中生物學效應仍有待臨床完善。綜上所述，部分肝切除肝再生過程中HAI-1顯著高表達，提示HAI-1參與調節肝細胞再生能力，而HAI-2并不干預肝細胞再生過程，考慮不同類型HAI因子間生物學作用存在差異，建議臨床深入研究。

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（2017-02-01收稿 2017-04-11修回）

（本文編輯 閆晶晶）

Study on the expressions of hepatocyte growth factor activator inhibitor -1, -2 after partial hepatectomy in rats

XI Rui, LI Xiao-tao, WANG Lu, WANG Li-juan*
Department of Hepatobiliary Surgery, Hanzhong Central Hospital, 723000, China *Corresponding author, E-mail: 344291852@qq.com

ObjectiveTo investigate the expressions of hepatocyte growth factor activator inhibitor (HAI-1 and HAI-2) expression after partial hepatectomy, to analyze the functions of HAI-1 and HAI-2 in liver regeneration. Methods Sixty healthy male SD rats were randomly divided into control group and hepatectomy group. Before operation and at 3 h, 12 h, 24 h and 48 h after operation, the expressions of HAI-1, HAI-2 mRNA and protein in the 2 groups were compared. Results Before operation, HAI-1, HAI-2 mRNA and protein expression levels were significantly low in the 2 groups, there were no significant differences between 2 groups (P＞0.05); When compared with the data before operation, there were no obvious changes on the HAI-1, HAI-2 mRNA and protein expressions of the control group (P＞0.05). However, the levels of HAI-1 mRNA and protein expression increased at first and then decreased gradually in the hepatectomy group after operation. When compared with the control group at the same time point, the difference was statistically significant (P＜0.05), but there were no significant changes in HAI-2 mRNA and protein (P＞0.05). Conclusions HAI-1 is highly expressed in the regeneration process after partial hepatectomy, it may be involved in the process of hepatocyte regeneration. But HAI-2 has no significant effect on liver regeneration.

liver resection; liver regeneration; HAI

R333.4

A

1007-8134(2017)03-0161-04

10.3969/j.issn.1007-8134.2017.03.009

723000，漢中市中心醫院肝膽外科（席銳、李曉濤、王璐、王麗娟）

王麗娟，E-mail： 344291852@qq.com