小鼠腦缺血再灌注模型的優化及其效果評價

2017-07-07 13:50:36劉震乾張清秀魏秀娥高紅陳默榮良群

東南大學學報(醫學版) 2017年3期

關鍵詞：小鼠模型

劉震乾，張清秀，魏秀娥，高紅，陳默，榮良群

(徐州醫科大學第二附屬醫院,江蘇徐州 221006)

·論著·

小鼠腦缺血再灌注模型的優化及其效果評價

劉震乾，張清秀，魏秀娥，高紅，陳默，榮良群

(徐州醫科大學第二附屬醫院,江蘇徐州 221006)

腦缺血再灌注；神經功能評分；腦梗死體積比；小鼠

隨著對腦缺血再灌注損傷及其防治機制研究的深入，動物模型模擬腦缺血再灌注的實驗技術越來越受關注[1]。目前小鼠腦缺血再灌注線栓模型主要都是經頸外動脈進栓，最終要結扎頸外動脈[2]，然而結扎頸外及其分支可以導致咀嚼肌受損、術后小鼠體重下降、神經功能恢復緩慢、神經功能缺損評分與實際腦梗死范圍相差較大等不良后果[3]，因此本研究采用結扎頸內動脈(LICA)術式對小鼠腦缺血再灌注模型進行了改進，并對其造模效果進行了評價。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

1.2 動物分組

所有小鼠于屏障環境內飼養3 d以上，保持室溫25 ℃、相對濕度55%，采用隨機分組的原則將小鼠隨機分為假手術組(Sham組)、LICA組、結扎頸外動脈組(LECA組)3組，每組30只。

1.3 小鼠腦缺血再灌注模型制備

LICA術式：(1)麻醉：小鼠腹腔注射10%水合氯醛，劑量為3.3 μl·g-1。(2)血管分離、打結：將小鼠仰臥位固定，行頸部正中切口，鈍性分離出右側頸動脈分叉(carotid bifuracation，CB)及其附近的頸總動脈(common carotid artery，CCA)、頸外動脈(external carotid artery，ECA)、頸內動脈(internal carotid artery，ICA)、枕動脈(occipital artery，OA)、翼腭動脈(pterygopalatine artery，PPA)和ICA近顱段，用縫合線在CCA、PPA以及ICA分叉處和ICA近顱端打活結(圖1a)。(3)進栓：在ICA分叉下方剪一小口，將硅膠線栓由剪口送入ICA，當線栓進入深度距離CB 9～10 mm時感到阻力，用預留于ICA的活結固定線栓，結扎ICA剪口處殘端，松開CCA、PPA處的活結(圖1b)。(4)拔栓：進栓80 min后將線栓拔出，結扎ICA近顱殘端。(5)縫合及術后護理：縫合小鼠頸部皮膚，并用碘伏消毒傷口。手術結束后，將小鼠放在25 ℃保溫毯上，小鼠蘇醒后放入屏障環境飼養籠中。整個LICA術式流程如圖2。

圖1 LICA術式進栓模式圖

參照Longa等[4]LECA術式：(1)麻醉：與LICA術式相同。(2)分離血管：將小鼠仰臥位固定，行頸部正中切口，鈍性分離右側胸鎖乳突肌內側緣分離出右側CCA，于右側舌骨下分離出右側ECA，在CB處分離出右側ICA。(3)進栓：用縫合線在CCA近心端打一活結以防滲血，用微動脈夾夾閉ICA，于ECA的嘴側與頸動脈分叉中間端剪一小口，將線栓經該剪口順頸外動脈插入，結扎并電灼游離ECA的嘴側端，將ECA游離段拉向外上方使之與ICA走向平行，將線栓順勢緩慢送入ICA，當線栓進入深度在9～10 mm時感到阻力，用預留縫合線固定線栓。(4)拔栓：80 min后將線栓拔出，同時結扎ECA游離端，松開CCA處活結。(5)縫合及術后護理：同LICA術式。Sham組僅作各個血管分離。

圖2 小鼠腦缺血再灌注模型LICA術式流程圖 a.小鼠麻醉后仰臥位固定，行頸部正中切口； b.體視鏡10倍鏡下，鈍性分離出右側CB處的CCA、ICA、ECA； c.體視鏡10倍鏡下，鈍性分離OA、PPA、ICA進顱段，于CB上方的CCA處打一活結； d.體視鏡40倍鏡下，于PPA、ICA近顱段打活結，在ICA進顱段松結上方剪口并進栓； e.體視鏡10倍鏡下，調整進栓深度并用活結固定線栓，線栓黑色標記提示進栓深度為距離CB以下9～10 mm，結扎剪口近心端ICA殘端，松開CCA、PPA處活結； f.體視鏡40倍鏡下，進栓80 min后將線栓拔出，結扎ICA殘端

1.4 神經功能缺損評分(neurological severity scores，NSS)

參考Menzies等[5]方法，分別于術后24 h、72 h、1周對各組小鼠進行NSS評分，最高分為18分(每項得分系不能完成要求執行的任務或缺少一項反射)，13～18分為嚴重損傷，7～12分為中度損傷，1～6分為輕度損傷。

1.5 測定小鼠腦梗死體積比

1.6 模型成功率及死亡率的比較

術后24 h分別以NSS 6分以上、TTC染色出現梗死病灶作為評價模型成功的標準，計算模型成功率。分別在術后24 h、72 h、1周計數各組小鼠的死亡數。

1.7 小鼠一般生存狀態評價

分別在術前及術后24 h、72 h、1周對小鼠的體重進行稱量并與術前體重進行比較，體重變化率(%)=(術前體重-術后各時間點體重)/術前體重×100%。同時對各組小鼠行Clark一般功能損傷評分[7]。

1.8 統計學處理

計量資料用均數±標準差表示，兩組間比較符合正態分布及方差齊性應用SPSS 10.0軟件進t檢驗分析，多組間比較采用方差分析，計數資料采用卡方檢驗，P<0.05表示差異具有統計學意義，用Spearman等級相關分析相關性。

2 結果

2.1 小鼠腦缺血再灌注模型成功率比較

術后24 h分別以NSS>6分、TTC染色出現明顯白色梗死病灶作為判斷模型成功的標準，如出現暗紅色病灶屬造模失敗。以NSS結果判斷各組造模成功率分別為0(Sham組，n=15)、93.3%(LECA組，n=15)、86.7%(LICA組，n=15)，NSS評分后再對各組小鼠斷頭、取腦、切片行TTC染色，TTC染色出現明顯白色梗死病灶判斷各組造模成功率分別為0(Sham組，n=15)、73.3%(LECA組，n=15)、93.3%(LICA組，n=15)，TTC染色可作為實際造模成功的判斷方法。以上提示采用LICA術式實際造模成功率(93.3%)更高，NSS評分判斷造模成功率(86.7%)與TTC染色判斷造模成功率(93.3%)具有較好的一致性。

2.2 小鼠腦缺血再灌注術后24 h腦梗死體積比與行為學相關性分析

進一步探討LICA術式下小鼠行為學評分與實際腦損傷程度的相關情況，Sham組小鼠TTC染色腦片呈均勻紅色，未見白色梗死病灶，腦梗死體積比為0；LECA組小鼠腦梗死體積比為(22.6±2.1)%，LICA組小鼠腦梗死體積比為(23.0±1.6)%，與Sham比較差異均有統計學意義(P<0.05)，LICA組與LECA組比較差異無統計學意義P>0.05。術后24 h Sham組NSS為0，LECA組NSS為12.2±2.7，LICA組NSS為9.5±2.2，與Sham組比較差異均有統計學意義(P<0.05)，LICA組與LECA組比較差異有統計學意義(P<0.05)。以上提示采用LICA術式不僅可以出現明顯的梗死病灶，同時可降低手術引起的神經功能損傷。

在術后24 h，NSS與腦梗死體積相關性分析中，LECA組NSS評分結果與腦梗死體積百分比無相關性(r=0.258，P>0.05)；LICA組NSS評分結果與腦梗死體積百分比顯著相關(r=0.766，P<0.01)。以上提示與LECA術式相比，采用LICA術式小鼠NSS與小鼠實際腦梗死體積具有顯著相關性。

2.3 術后不同時間小鼠體重變化率

分別于術前及術后24 h、72 h、1周測量小鼠體重。各組小鼠體重變化率：Sham組(n=15)各時間點為0，LECA組(n=15)24 h、72 h、1周分別為(7.8±0.34)%、(16.1±0.39)%、(9.1±0.3)%，LICA組(n=15)分別為(4.8±0.6)%、(9.7±0.2)%、(3.2±0.7)%。術后各時間點3組間小鼠體重變化率比較差異均有統計學意義(P<0.05)，提示應用LICA術式減少了小鼠術后各時間點體重的減輕情況。

2.4 術后不同時間小鼠死亡率的變化

分別于術后24 h、72 h、1周對小鼠的死亡情況進行計數，LECA組小鼠在術后3個時間點死亡率均高于LICA組，提示與LECA術式相比采用LICA術式降低了術后3個時間點小鼠的死亡率(圖3)。

2.5 術后不同時間點小鼠Clark一般功能損傷評分

臨床上可將缺血性腦卒中患者的神經功能損傷情況劃分為一般功能損傷和局灶性功能損傷。一般功能損傷可以反映患者的生命狀態和神經功能損傷的整體情況，Clark一般功能損傷評分正是從小鼠整體神經功能損傷情況來評價小鼠的一般生存狀態。本研究對小鼠術后24 h、72 h、1周行Clark一般功能損傷評分。在術后各時間點LICA組小鼠Clark一般功能損傷評分與LECA組相比差異均有統計學意義(P<0.05)，提示采用LICA術式較之LECA術式可以提高小鼠的一般生存狀態，減少手術操作因素引起的一般功能損傷(圖4)。

圖3 3組小鼠術后24 h、72 h、1周死亡率的變化

3 討論

近年來隨著基因工程研究的飛速發展，轉基因大鼠已有一定應用[8]，但小鼠與人類基因組具有較高的同源性[9]，將小鼠作為腦缺血再灌注的模型動物越來越受到關注。本研究著重探討優化小鼠腦缺血再灌注模型的方法，并對造模方法進行比較及評價。然而在動物實驗過程中，諸多因素影響著小鼠腦缺血再灌注模型制作的成功與否，現將LICA術式操作注意事項總結如下：

目前LECA術式已經得到了很好的應用，考慮到該術式對ECA及其分支的破壞作用從而影響小鼠進食及神經行為學評分，國內有人提出LECA術式的簡化法[11]，此法雖然操作簡便但結扎一側CCA對血流動力學產生的影響不可忽略，同時僅靠Willis環實現再灌注并不能真正模擬缺血再灌注病理生理過程，尤其是不同小鼠品系健側代償能力差別較大，對代償較差的小鼠品系而言，手術側ECA、PPA灌流皆受影響，PPA受損后可導致吞咽困難、視力下降甚至眼盲，死亡率較高。因此此法很難應用于腦缺血再灌注損傷的系統性研究。本研究所使用的LICA術式實現對動物模型優化的原因之一正是通過減輕了對PPA的損傷。

手術過程中我們發現PPA有一定的對側代償能力，應用經典的LECA術式，PPA可以通過線栓的尾部對大腦中動脈(MCA)及其周圍分支動脈實現代償，最終導致模型一致性較差甚至造模失敗。國內曾有人提出在LECA經典術式的基礎上結扎游離PPA[12]，而PPA的分支包括眼動脈、翼管動脈、咽動脈等重要分支動脈，結扎游離PPA勢必會對小鼠一般功能狀態造成嚴重影響。因此本研究所采用的LICA術式，既避免了PPA的復灌，又避免了對PPA的損傷。

綜上所述，本研究探討了LICA術式對小鼠腦缺血再灌注損傷模型的優化，通過比較我們發現,LICA術式減少了對顱內外血管的破壞，小鼠一般功能狀態受損較小，生存率得到改善，為研究神經元的死亡、再生修復以及藥物的干預作用提供一種了更為穩定可靠的造模方法。