SPI shRNA分子探針用于荷瘤裸鼠MR檢查的最佳掃描濃度探討

廖蕤堃，曾丹妮，張竹，張力強，SAGAR Thapa，文明

(重慶醫科大學附屬第一醫院 放射科，重慶 400016)

·論 著·

廖蕤堃，曾丹妮，張竹，張力強，SAGAR Thapa，文明

(重慶醫科大學附屬第一醫院 放射科，重慶 400016)

超順磁性氧化鐵； 分子探針； 磁共振成像； 掃描濃度； 裸鼠

1 材料與方法

1.1 主要材料及設備

探針由課題組制備，并獲得國家發明專利授權(專利號：ZL201410064217.6)；SKOV3腫瘤細胞株(中國科學院上海細胞庫)；細胞培養基RPMI 1640及胎牛血清(美國GIBCO公司)；0.25%胰蛋白酶(美國HYCLONE公司)；磷酸緩沖液(PBS)；CO2恒溫細胞培養箱(美國Thermo Forma公司)；BALB/c裸鼠，雌性，4～6周齡，體重(22±3)g，購買并飼養于重慶醫科大學動物實驗中心(省部級共建重點實驗室)；戊巴比妥鈉(德國Merck公司)；核固紅(武漢博士德生物工程有限公司)；亞鐵氰化鉀[生工生物工程(上海)有限公司]，3.0 T超導型MR成像儀及腕關節線圈(美國GE公司)。

1.2 實驗方法與步驟

1.2.1 SKOV3腫瘤細胞株培養及荷瘤裸鼠模型建立

參照課題組既往的成熟方法[3]，將SKOV3卵巢癌細胞株置于含有10%胎牛血清及RPMI 1640培養基內常規(恒溫37 ℃、濃度為5%CO2孵箱中)培養，選擇對數期生長細胞，用0.25%胰蛋白酶消化，收集至10 ml離心管內，以800 r·min-1離心5 min，隨后用無血清、無抗生素細胞懸液稀釋至細胞濃度為5×107個·ml-1備用。BALB/c裸鼠30只，統一在每只后背部近左側大腿區域皮下接種SKOV3腫瘤細胞懸液約0.2 ml(含細胞數約為1×107個)，常規飼養，每天定時(人為規定在上午10：00)觀察并記錄裸鼠精神狀態、飲食及腫瘤生長情況，接種后(20±5)d瘤體直徑大于1.0 cm，提示荷瘤裸鼠建模成功，可以用于進一步的實驗。

1.2.2 探針注射后荷瘤裸鼠活體MR掃描

1.2.2.3 MR掃描參數設置及掃描序列選擇 考慮到掃描時間為探針注射后27 h，若注射前至MR掃描結束這段時間內持續麻醉荷瘤裸鼠，可能因為不符合動物的生活狀態而影響實驗效果，故而選擇在注射探針前先行MR掃描作為對照，掃描結束后各組分別注射不同濃度的探針，放回動物實驗中心常規分盒飼養，在尾靜脈注射探針27 h開始再次MR掃描，兩次掃描的部位、參數及序列一致。

在每次MR掃描前均將2%戊巴比妥鈉麻醉[劑量為0.1 ml·(20 g)-1]注入荷瘤裸鼠腹腔內，置于自制泡沫板上，醫用膠布俯臥位固定，待其呼吸頻率降低且呼吸平穩后(目的在于減少呼吸偽影對MR圖像的干擾)，置于腕關節線圈內，行MR橫斷位及冠狀位掃描。

在參照文獻[7]基礎上，經反復預實驗并適當調整，最終用于實驗的參數如下：(1)T1WI快速自旋回波序列FSE：脈沖序列重復時間/回波時間(TE/TR) 85/300 MinFull, 冠狀位FOV 11 cm，橫斷位FOV 6 cm，激勵次數3，層厚 2 mm，間距0.5 mm，矩陣320×224，翻轉角20°；(2)T2WI FSE：TE/TR 85/600 ms，FOV 6 cm，激勵次數3，層厚2 mm，矩陣320×256，翻轉角17°；(3)T2*GRE梯度回波(GRE)：TE/TR 300 ms/MinFull，FOV 6 cm，激勵次數3，層厚2 mm，間距 0.5 mm，矩陣320×256，翻轉角20°。

1.2.2.4 MR圖像采集及分析 采集掃描圖像并傳輸至GE AW 4.6工作站，分別測量最大層面腫瘤及對側肌肉組織信號強度。為避免誤差，人為規定感興趣區(region of interest ROI)圖形為方形游標，面積為20 mm2，測量3次，記錄其平均值。

1.2.2.5 病理切片及染色 第2次MR掃描結束后，立即經腹腔注入過量的2%戊巴比妥鈉處死裸鼠，取腫瘤組織及荷瘤對側肌肉組織，以10%緩沖福爾馬林液固定，48 h后行石蠟包埋切片，分別行HE及普魯士藍染色，光鏡下觀察。

1.3 統計學處理

計量結果以均數±標準差表示，使用SPSS 18.0軟件，濃度組間比較采用方差分析，組間多重比較采用LSD分析，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 裸鼠模型建立

對數期SKOV3腫瘤細胞經皮下注射后，于實驗動物中心統一飼養，30只荷瘤裸鼠生長良好，無一只死亡。在注射(20±5)d，瘤體長徑大于1 cm，色澤紅潤、形態規則(圖1)。6、12、18、24、30 mg·kg-1濃度組腫瘤組織體積依次為(1 518.5±605)、(1 641±498)、(1 523±397)、(1 705±580)、(1 400±387)mm3，各濃度組間腫瘤組織體積大小差異無統計學意義(P>0.05)。

圖1 接種腫瘤細胞并飼養18 d

Fig 1 18 d breeding after inoculation

2.2 裸鼠MR成像結果

探針注射前無裸鼠死亡，探針注射后30 mg·kg-1組立即死亡1只，MR掃描結束后24、30 mg·kg-1組各死亡1只(實驗過程中均采取保溫等相關防護措施，盡量模擬飼養條件)，其余27只裸鼠均存活。

2.2.1 T1WI FSE信號強度變化

不同濃度組的腫瘤組織均出現信號強度改變，與探針注射前比較差異有統計學意義(P<0.05)；18、24、30 mg·kg-1組較6、12 mg·kg-1組差異更顯著，而18、24、30 mg·kg-1組間差異無統計學意義；對側相應區域肌肉組探針注射后信號改變較注射前差異無統計學意義。見表1和圖2。

組 織組織信號強度注射前6mg·kg-1組12mg·kg-1組18mg·kg-1組24mg·kg-1組30mg·kg-1組腫 瘤732±35777±29a798±32a843±28a865±33a876±41a對側肌肉588±31613±24621±44634±21625±29619±26

a 與注射前比較，P<0.05

圖2 探針注射后不同濃度組腫瘤組織T1信號變化圖像(橫斷位)

Fig 2 Diagram of signal intensity T1WI FSE in tumor tissues after injected with molecular probe at different concentrations(Axial)

2.2.2 T2WI FSE信號強度變化

不同濃度組腫瘤組織于探針注射后均出現信號強度改變，與注射前比較差異有統計學意義(P<0.05)；18、24、30 mg·kg-1組較6、12 mg·kg-1組改變更為明顯，18、24、30 mg·kg-1組間差異無統計學意義；對側相應區域肌肉組織探針注射后信號改變較注射前差異無統計學意義。見表2和圖3。

組 織組織信號強度注射前6mg·kg-1組12mg·kg-1組18mg·kg-1組24mg·kg-1組30mg·kg-1組腫 瘤566±40479±31a358±33a247±43b229±39b214±29b對側肌肉218±22203±12216±18207±19194±21199±17

a 與注射前比較，P<0.05； b 與注射前比較，P<0.001

2.2.3 T2*GRE信號強度變化

不同濃度組腫瘤組織于探針注射后均出現信號強度改變，與注射前比較差異有統計學意義(P<0.05)；18、24、30 mg·kg-1組較6、12 mg·kg-1組改變更為明顯，18、24、30 mg·kg-1組間差異無統計學意義；對側相應區域肌肉組織探針注射后信號改變較注射前差異無統計學意義。腫瘤大致變化趨勢與T2WI相似。見表3和圖4。

2.3 病理結果

各濃度組的腫瘤組織HE染色結果類似，以24 mg·kg-1組為例，可見腫瘤組織結構紊亂，瘤細胞形態不規則，大小不一致，細胞核異型性較多，部分可見核分裂象改變(圖5)；肌肉組織無明顯變性、壞死等征象顯示。

普魯士藍染色結果，探針注射前各濃度組腫瘤組織中未見藍染顆粒；注射探針后各濃度組均可以見腫瘤組織中存在藍染顆粒，當探針濃度為18、24、30 mg·kg-1時藍染顆粒較多(圖6)，而對照的肌肉組織中未見藍染顆粒。

3 討 論

圖3 探針注射后不同濃度組腫瘤組織T2信號變化圖像(冠狀位)

Fig 3 Diagram of signal intensity T2WI FSE in tumor tissues after injected with molecular probe at different concentrations(Coronal)

組 織組織信號強度注射前6mg·kg-1組12mg·kg-1組18mg·kg-1組24mg·kg-1組30mg·kg-1組腫 瘤536±23478±29a355±35a288±15b304±24b299±18b對側肌肉561±28510±21511±22506±30488±29492±32

a 與注射前比較，P<0.05； b 與注射前比較，P<0.001

圖4 探針注射后不同濃度組腫瘤組織T2*GRE信號變化圖像(橫斷位)

Fig 4 Diagram of signal intensity T2*GRE in tumor tissues after injected with molecular probe at different concentrations(Axial)

圖5 24 mg·kg-1組HE染色結果 ×400

Fig 5 HE straining images(×400)

本課題組前期實驗結果及相關文獻[2]報道均表明，探針注射24 h后主要富集于活體肝臟、脾臟中，這與共識的網狀內皮系統吞噬作用相吻合，同時在MR掃描的T2*GRE序列表現為信號減低。隨著探針劑量的加大，肝、脾信號強度呈梯度減低，這些結果為本實驗設置濃度梯度提供了依據。分析以上各濃度組掃描圖像及信號值，探針注射腫瘤組織均出現信號強度減低，也印證了前期的實驗結果。另外，24、30 mg·kg-1組部分裸鼠在探針注射后立即或隨后掃描中相繼出現死亡現象，我們推測與探針濃度過高有關，即裸鼠無法耐受24 mg·kg-1以上的探針濃度，提示24、30 mg·kg-1不是理想的探針濃度。隨后的實驗結果也表明，當探針濃度為18 mg·kg-1時，腫瘤組織在T1WI上呈輕度升高，而T2WI及T2*GRE上呈低信號改變，探針濃度在裸鼠耐受范圍內且信號強度改變較其余各組明顯，能達到肉眼所能分辨程度。因此，活體荷瘤裸鼠MR掃描最佳的探針濃度為18 mg·kg-1。此外，對側相應區域肌肉組織T1WI、T2WI、T2*GRE信號無明顯變化，且與腫瘤組織變化趨勢不盡相同，信號差別明顯，在圖像上能夠得到較好的分辨。病理結果也表明，腫瘤組織中藍染鐵顆粒表達較豐富，而肝臟、脾臟中僅存在少量鐵顆粒染色，與MR圖像觀察結果一致。由此可以推斷出，本課題組制備的納米級分子探針(平均粒徑為7.37 nm)[12]，能夠大部分逃避網狀內皮系統的吞噬，易于透過血管及組織間隙，并成功富集于腫瘤組織中，達到了實驗的預期目的。

圖6 各濃度組普魯士藍染色結果 ×400

Fig 6 Prussian blue straining images(×400)

(DepartmentofRadiology,theFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

superparamagnetic iron oxide; molecular probe; magnetic resonance imaging; scanning concentration；nude mice

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