白色念珠菌對人口腔黏膜上皮角質細胞凋亡和增殖的影響探討

魯統斌，高存良，郭璟璟

（山東省莒南縣人民醫院，山東 臨沂 276600）

白色念珠菌對人口腔黏膜上皮角質細胞凋亡和增殖的影響探討

魯統斌，高存良，郭璟璟

（山東省莒南縣人民醫院，山東 臨沂 276600）

目的探討分析白色念珠菌對人口腔黏膜上皮角質細胞（HOK，human oral keratinocytes）凋亡和增殖的影響。方法選取2015年8月-2016年8月期間我院66例體檢健康者頰黏膜，對HOK進行培養，于菌絲型和孢子型白色念珠菌中加入制備的HOK，并分組，前者作為菌絲組，后者作為孢子組，而對照組則為單純HOK，通過對比研究的方式，探討白色念珠菌對HOK產生的影響。結果菌絲組凋亡率、G0/G1期、S期、G2/M期、PI與對照組、孢子組對比（P<0.05），而孢子組與對照組在凋亡率、G0/G1期、S期、G2/M期、PI方面對比，差異不明顯（P>0.05）。結論HOK的增殖和凋亡與白色念珠菌有著密切關系，其能夠引起HOK在調往率方面表現出升高的趨勢，改變HOK增殖周期。

人口腔黏膜上皮角質細胞；白色念珠菌；凋亡；增殖

0 引言

白色念珠菌（Monilia albican），存在于健康者時，并不會導致其發生疾病，但是，存在于菌群之間的制約性失調或者免疫能力降低的人體，可誘發相應疾病，有較強的致病性[1]，而對于口腔念珠菌病而言，病原菌中最為主要的則是白色念珠菌，同時，疾病具有反復不愈的特點，對人類健康生活造成影響，而HOK作為白色念珠菌侵襲的防御點[2]，目前臨床上對白色念珠菌對于HOK產生的作用研究報道較少，因此，本文則通過探討白色念珠菌對HOK增殖與凋亡造成的影響，內容匯報如下：

1 材料與方法

1.1 材料

由中科院微生物研究所提供白色念珠菌標準菌株（ATCC 11006）、HOK（體檢健康者，均為自愿提供，提取前未服用過藥品）、廣州市齊云生物技術有效公司生產的SDA（沙堡葡萄糖瓊脂培養基）、FBS（胎牛血清）、YPD固定培養基（沙堡瓊脂培養基干粉）、YPD液體培養基（沙堡液體培養基干粉），其余材料由我院實驗室提供。

1.2 方法

（1）白色念珠菌[3]：于SDA中完成對ATCC 11006的培養，進行三次轉種，根據0.5麥式濁度=106CFU/ml的標準，對致病菌配置為懸浮液，而配置濃度則為3×105CFU/ml。（2）菌絲型白色念珠菌：將配置的白色念珠菌置于RPMI 1640培養基（pH：7.0、10%FBS）中進行培養，于溫度為37℃的情況下，以靜止的方式，進行3小時的培養，從而將菌絲型白色念珠菌誘導出。（3）孢子型白色念珠菌[4]：應用劃線法的方式，將配置的白色念珠菌接種于YPD固體培養基，于37℃的溫度下，將乳白色奶油狀菌落，于離心管（15ml）中裝入YPD液體培養基，再將菌落轉種于離心管（轉速：200r/min、時間：18h、溫度：37℃），從而完成得到孢子型白色念珠菌的操作。（4）HOK[5]：嚴格按照無菌操作，對體檢健康者頰粘膜進行切取，清洗則應用PBS，實施11-12h的消化操作，從而得到上皮層，之后對其進行3次漂洗操作后，混合消化液（0.02%EDTA:0.05%胰蛋白酶=1:1），進行離心操作，置于培養箱（5%、37%二氧化碳飽和濕度細胞培養箱），待細胞生長融合情況，達到80%培養皿時，實施傳代的培養操作，而本文實驗應用第二代細胞。（5）實驗分組：選取2015年8月-2016年8月期間我院66例體檢健康者頰黏膜，對HOK進行培養，其中男性34例、女性32例；年齡18-42歲、平均年齡（30.2±5.1）歲；HOK培養2d后，將培養液去掉，細胞貼壁，實施PBS3次清洗后，分為對照組、菌絲組、孢子組。

1.3 觀察指標

周期細胞：G2/M期、S期、G0/G1期；PI（細胞增殖指數）：PI=[（S+G2/M）/G0/G1+S+G2/ M]×100%[6]；細胞凋亡率。

1.4 統計學方法

2 結果

菌絲組凋亡率、G0/G1期、S期、G2/M期、PI與對照組、孢子組對比（P<0.05），而孢子組與對照組在凋亡率、G0/G1期、S期、G2/M期、PI方面對比（P>0.05），詳見表1：

表1 三組觀察指標結果對比

表1 三組觀察指標結果對比

注釋：^與對照組、孢子組對比，^P<0.05，*與對照組對比，*P>0.05。

組別凋亡率（%）周期細胞PI G0/G1期S期G2/M期菌絲組3.88±0.37^35.01±5.22^9.25±2.03^19.85±2.16^45.98±2.86^孢子組2.15±0.52*47.35±6.30*6.37±1.45*13.49±2.39*25.52±3.16*對照組1.75±0.1350.31±5.255.78±1.1911.39±2.1622.50±2.79

3 討論

白色念珠菌是臨床上的一種真菌，常常于陰道、上呼吸道、口腔等中存在，可通過大量的繁殖、將生長形式改變為芽生菌絲相，從而對細胞進行侵襲，引發疾病，而菌絲型、孢子型是白色念珠菌的兩種形態，后面一種形態可向菌絲型轉化，可通過對口腔黏膜上皮的黏附、侵襲及破壞作用，損傷HOK，最終導致患者發生口腔念珠菌病。細胞凋亡在臨床上又被稱之為細胞程序化死亡，與細胞壞死相反，過程具有主動性，常常于腫瘤發展、組織退化等中存在，對基因可發揮調控、表達、激活等作用，而在口腔黏膜一些病損組織中有膠樣小體，因此，口腔病變、細胞凋亡，兩者之間有著相關性，細胞增殖的方式為分裂，是生物體發育、生長、遺傳、繁殖基礎，而口腔黏膜癌前病變與口腔黏膜上皮出現異常增生現象有著關聯性。細胞周期可分為M期、G1期、S期、G2期、G0期，其中S期表示DNA的合成期，通過情況下，G2/M期比例比較高，而S期細胞繁殖比較旺盛，而PI表明細胞增殖情況，反應出細胞繁殖能力[7-8]，而從本文表1研究結果可知，在HOK細胞增殖中，菌絲型白色念珠菌具有促進的作用，分析其中的機制可能是由于細胞從G1期轉變為S期，從而使DNA合成方面加速，最終導致S期、G2/M期細胞百分數表現出顯著增高的情況，從而也就有菌絲組PI顯著高于對照組和孢子組（P<0.05）的結果，而菌絲組細胞凋亡率明顯比對照組和孢子組高（P<0.05），提示，在HOK毒性方面，菌絲性白色念珠菌優于孢子型，能夠將HOK凋亡加快。

綜上所述，菌絲型白色念珠菌對HOKG0/G1期細胞百分數的下降、S期、G2/M期細胞百分數的升高具有誘導作用，能夠使HOK周期細胞發生改變，因而，菌絲型白色念珠菌能夠使細胞增殖指數增高，同時，對HOK凋亡率上升具有誘導的作用，因此，臨床針對口腔念珠病患者進行治療時，可通過對菌絲型白色念珠菌的控制，選取治療方案和判斷療效。

[1] 仵楠,代海濤,徐江,等.維吾爾族高齲兒童口腔中白色念珠菌基因分型研究[J].實用口腔醫學雜志,2016,32(2):252-255.

[2] 張輝,俞誠波,張蓓蓓,等.白色念珠菌對人口腔黏膜上皮角質細胞的作用研究[J].中國醫藥導報,2015,35(1):4-7.

[3] 孫富麗,張英,聞妍,等.白色念珠菌對人口腔黏膜上皮角質細胞的黏附作用及影響因素研究[J].中國實用口腔科雜志,2015,8(6):350-354.

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[6] 錢雅潔,蔣文暉,王翔,等.白色念珠菌白斑中核苷酸結合寡聚化結構域1、核因子κB及人β-防御素的表達[J].中華口腔醫學雜志,2014,49(8):464-469.

[7] 蔣文暉,王文梅,王翔,等.白色念珠菌感染對口腔白斑中RIP2和Caspase－12表達的影響[J].臨床口腔醫學雜志,2015,31(8):469-472.

[8] 耿芳惠,孫紅英,王夏夏,等.白色念珠菌對人口腔黏膜上皮角質細胞凋亡和增殖的影響[J].現代生物醫學進展,2016,16(2):209-211.

Effects of Candida albicans on apoptosis and proliferation of human oral mucosal epithelial cells

LU Tong-bin,Gao Cun-liang,GUO Jing-jing
(The People's Hospital of Junan County , Linyi, Shandong, China)

Objective:To study the analysis of candida albicans to human oral mucosal epithelial keratinocytes (HOK, human oral keratinocytes) apoptosis and proliferation. SelectionMethodsAugust 2015 - August 2016 during physical examination in 66 cases healthy buccal mucosa, to cultivate HOK, the hyphae and spores add preparation HOK, candida albicans and grouping, the former as hyphae group, the latter as the spore group, while the control group for pure HOK, through the way of comparative study, discusses the impact of candida albicans to HOK.ResultsApoptosis rate of mycelia group, G0 / G1 phase and S phase and G2 / M phase, PI, spore group compared with control group (P<0.05), while the spore group and control group in the apoptosis rate, G0 / G1 phase and S phase and G2 / M phase contrast, PI, no significant difference (P>0.05).ConclusionThe proliferation and apoptosis of HOK has close relationship with candida albicans, it can cause HOK in transferred to rate showed a rising trend, change the HOK proliferation cycle.

Oral mucosa epithelial keratinocytes; Candida albicans. Apoptosis; Proliferation

10.19335/j.cnki.2096-1219.2017.05.71