金銀花炒炭前后6種成分的含量變化研究Δ

吳明俠，李 會，崔永霞，侯珊珊，丁亞慧（河南中醫藥大學分析測試中心，鄭州 450046）

金銀花炒炭前后6種成分的含量變化研究Δ

吳明俠＊，李 會，崔永霞#，侯珊珊，丁亞慧（河南中醫藥大學分析測試中心，鄭州 450046）

目的：建立同時測定金銀花中6種成分含量的方法，并研究金銀花炒炭前后上述成分含量的變化。方法：采用超高效液相色譜法。色譜柱為Agilent Eclipse Plus C18RRHD，流動相為0.1%磷酸溶液-乙腈（梯度洗脫），流速為0.2m L/m in，檢測波長為350 nm，柱溫為25℃，進樣量為1μL。結果：綠原酸、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C檢測進樣量線性范圍分別為21.2～424μg（r＝0.999 3）、1.17～23μg（r＝0.999 5）、2.18～43μg（r＝0.999 8）、5.10～102μg（r＝0.999 3）、2.60～52μg（r＝0.999 1）、4.95～99μg（r＝0.999 8）；精密性、穩定性、重復性試驗的RSD＜2.0%；加樣回收率分別為97.11%～99.76%（RSD＝1.20%，n＝6）、95.20%～99.90%（RSD＝2.20%，n＝6）、95.71%～100.30%（RSD＝2.20%，n＝6）、95.00%～96.98%（RSD＝0.88%，n＝6）、96.47%～103.00%（RSD＝2.40%，n＝6）、95.78%～103.80%（RSD＝3.20%，n＝6）。與炮制前比較，炮制后的金銀花中蘆丁、異綠原酸B、異綠原酸C的含量增加，綠原酸、異綠原酸A的含量明顯下降，而木犀草苷的含量無明顯變化。結論：該方法操作簡便，精密度、穩定性、重復性好，可用于金銀花中6種成分含量的同時測定；金銀花炒炭前后化學成分有一定變化。

金銀花；炒炭；超高效液相色譜法；含量；變化

金銀花炭收載于1990年版《中國藥典》、1988年版《全國中藥炮制規范》及各省炮制規范。金銀花炒炭后寒性減弱，并具澀性，有止血作用，多用于血痢、崩漏，亦可用于吐血、衄血[1]。目前，國內外對金銀花藥材的化學成分、藥理活性及作用機制研究較多[2-5]，而對金銀花炭止血機制研究尚不深入[6-8]。本課題組從金銀花炒炭前后多種化學成分變化來分析其炮制機制，旨在為從藥效學、藥理學的角度研究金銀花炭的止血機制提供理論基礎。

1 材料

1.1 儀器

1290型超高效液相色譜儀，包括1260DAD檢測器（美國Agilent公司）；JP-1500B-8型高速多功能粉碎機（永康市久品工貿有限公司）；KQ5200DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：300W，頻率：70 kHz）；XS105DU型十萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；FA2004B型萬分之一電子分析天平（上海精科天美科學儀器有限公司）。

1.2 試劑

綠原酸對照品（批號：110753-200212）、蘆丁對照品（批號：110080-200306）、木犀草苷對照品（批號：111520-200201）均購自中國食品藥品檢定研究院，純度均＞98%；異綠原酸A對照品（批號：MUST-09061601）、異綠原酸B對照品（批號：MUST-09061602）、異綠原酸C對照品（批號：MUST-09041001）均購自成都曼思特生物科技有限公司，以上對照品純度均＞98%；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 藥材

金銀花藥材購于河南中醫藥大學第三附屬醫院，經河南中醫藥大學董誠明教授鑒定為真品；金銀花炭是在河南中醫藥大學炮制學科石延榜高級實驗師指導下炒制。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18RRHD（50mm×2.1 mm，1.8μm）；流動相：0.1%磷酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～2 m in，15%B；2～2.5 m in，15%→18%B；2.5～8min，18%B）；流速：0.2m L/min；檢測波長：350 nm；柱溫：25℃；進樣量：1μL[9]。色譜見圖1。

2.2 混合對照品溶液的制備

精密稱取待測成分對照品各適量，加甲醇溶解制成綠原酸、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C質量濃度分別為106.00、5.86、10.90、25.50、13.00、24.75μg/m L的混合對照品溶液。

2.3 金銀花炭樣品的制備

取金銀花藥材適量，共3份，每份約200 g，分別置于炒鍋中，炒制溫度為270℃，炒制時間為8.5min，炒至外焦褐色內焦黃色，取出，晾干，即得。

2.4 供試品溶液的制備

取金銀花藥材及其炭品粉末（過4號篩）各約0.25 g，精密稱定，分別置于具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇30m L，超聲處理45m in，稱定質量，加70%乙醇補足減失的質量，搖勻，經0.45μm微孔濾膜濾過，即得。

圖1 超高效液相色譜圖Fig 1 UPLC chromatograms

2.5 線性關系考察

分別精密量取“2.2”項下混合對照品溶液0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分進樣量（x，μg）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程與線性范圍，詳見表1。

表1 回歸方程與線性范圍Tab 1 Regression equationsand linear ranges

2.6 精密度試驗

取“2.2”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果，綠原酸、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C峰面積的RSD分別為0.28%、0.47%、0.83%、1.01%、0.74%、0.66%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩定性試驗

取“2.4”項下金銀花炭供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，綠原酸、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C峰面積的RSD分別為0.33%、0.51%、0.79%、0.85%、0.46%、0.53%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內基本穩定。

2.8 重復性試驗

精密稱取同一批金銀花炭樣品適量，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，綠原酸、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C峰面積的RSD分別為0.95%、1.07%、1.22%、1.56%、1.37%、1.78%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗

取已知含量金銀花炭樣品適量，共6份，分別加入一定質量的待測成分對照品，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表2。

表2 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 2 Resultsof recovery test（n＝6）

2.10 樣品含量測定

取樣品各適量，分別按“2.4”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，結果見表3。

表3 樣品含量測定結果（n＝3，mg/g）Tab 3 Resultsof contentdetermination of samples（n＝3，mg/g）

3 討論

通過炮制前后化學成分的變化發現，金銀花經炒炭后，增加的主要成分有蘆丁、異綠原酸B、異綠原酸C，而綠原酸和異綠原酸A的含量明顯下降，木犀草苷的含量變化不明顯。分析各成分含量變化的原因，可能是綠原酸和異綠原酸類化合物結構不穩定，隨著炮制時間延長及炮制溫度改變其結構發生改變，加熱后一部分轉化成異綠原酸B、C，一部分結構分解破壞，總綠原酸類成分含量呈現下降趨勢。但金銀花炮制前后這6種成分含量的變化，是否與金銀花炒炭后止血作用增強、抑菌能力下降等藥理活性改變有關，仍有待進一步的試驗驗證。

[1] 孫赫.金銀花藥性與臨床應用的文獻研究及系統性評價[D].長沙：湖南中醫藥大學，2015.

[2] 宋亞玲，倪付勇，趙祎武，等.金銀花化學成分研究進展[J].中草藥，2014，45（24）：3656-3664.

[3] 莊麗，張超，阿里穆斯.金銀花的藥理作用與臨床應用研究進展[J].遼寧中醫雜志，2013，40（2）：378-381.

[4] 羅時旋，趙稷，張宇，等.代謝組學法考察金銀花醇提物對模型小鼠肝損傷的預防作用[J].中國藥房，2015，26（22）：3109-3112.

[5] 馬官英，張慶剛，鐘瑞華，等.金銀花總黃酮對氧化應激中肝星狀細胞的保護作用[J].中國藥房，2014，25（31）：2895-2897.

[6] 王英姿，張兆旺.金銀花炮制研究述評[J].山東中醫藥大學學報，2000，24（1）：66-59.

[7] 黃艷英，黃敏，陸中海.金銀花炮制的實驗研究[J].中藥材，1994，17（1）：25-26.

[8] 叢悅，王艷，李勉.金銀花炮制機制的初步探討[J].河南大學學報（醫學版），2009，28（4）：242-246.

[9] 韓永成，劉偉，陳寧，等.UPLC法同時測定金銀花中6種有效成分的含量[J].天然產物研究與開發，2015，27（1）：89-93.

Study on Content Changesof 6 Components in Lonicera japonica before and after Carbonized

WU M ingxia，LIHui，CU IYongxia，HOU Shanshan，DING Yahui（Center of Analysisand Testing Henan University of Chinese Medicine，Zhengzhou 450046，China）

OBJECTIVE：To establish themethod for simultaneous determination of 6 components in Lonicera japonica，and to study the content changes of them before and after before and after carbonized.METHODS：UPLCmethod was adopted.The determ ination was performed on Agilent Eclipse Plus C18RRHD column w ith mobile phase consisting of 0.1%phosphoric acid solutionacetonitrile（gradient elution）at the flow rate of 0.2 m L/m in.The detection wavelength was set at 350 nm，and column temperaturewas 25℃.The sample size was 1μL.RESULTS：The linear ranges of chlorogenic acid，rutin，galuteolin，isochlorogenic acid A，isochlorogenic acid B and isochlorogenic acid C were 21.2-424μg（r＝0.999 3），1.17-23μg（r＝0.999 5），2.18-43μg（r＝0.999 8），5.10-102μg（r＝0.999 3），2.60-52μg（r＝0.999 1），4.95-99μg（r＝0.999 8），respectively.RSDs of precision，stability and repeatability tests were all lower than 2.0%.Recoveries were 97.11%-99.76%（RSD＝1.20%，n＝6），95.20%-99.90%（RSD＝2.20%，n＝6），95.71%-100.30%（RSD＝2.20%，n＝6），95.00%-96.98%（RSD＝0.88%，n＝6），96.47%-103.00%（RSD＝2.40%，n＝6），95.78%-103.80%（RSD＝3.20%，n＝6）.Compared w ith before processing，the contents of rutin，isochlorogenic acid B and isochlorogenic acid C in L.japonica were increased along w ith processing，the contents of chlorogenic acid and isochlorogenic acid A were decreased significantly，while the content of galuteolin had no significant change.CONCLUSIONS：Themethod is simple，precise，stable and repeatable，and can be used for simultaneous determ ination of 6 components in L.japonica.Those chem ical components have certain changes before and after carbonized.

Lonicera japonica；Carbonize；UPLC；Content；Change

R927.2

A

1001-0408（2017）15-2112-03

2016-06-31

2016-11-03）

（編輯：張 靜）

河南省高等學校重點科研項目（No.17A360022）；河南中醫藥大學科研苗圃工程項目（No.MP2016-17）

＊副教授。研究方向：中藥質量控制和新藥研發。E-mail：mxwu711@163.com

#通信作者：副教授。研究方向：中藥質量控制和新藥研發。E-mail：1020076356@qq.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.15.27