水熱法制備CdSe量子點及其在細胞成像上的應用

馬詩瑤++羅沙++王藝凝++岳桐++趙丹

摘要：指出了CdSe量子點作為一種新興的熒光標記納米材料，被廣泛應用于生物醫學等領域。提出了一種以亞硒酸鈉為硒源，N-乙酰-L-半胱氨酸為穩定劑，采用水熱法一步合成高質量水溶性CdSe量子點的新方法。實驗考察了反應物的投料比及其加入順序對CdSe量子點熒光性能的影響，并從中優化CdSe量子點的合成條件，用熒光光譜對CdSe量子點的發光性能進行了表征。選取最佳條件下制備的CdSe量子點標記人肝癌細胞，N-乙酰-L-半胱氨酸修飾的CdSe量子點具有良好的水溶性和生物相容性，能很好地對人肝癌細胞進行熒光成像。

關鍵詞：CdSe量子點；水熱法；熒光；細胞成像

中圖分類號：R318

文獻標識碼：A 文章編號：16749944（2017）10022304

1 引言

量子點（quantum dots），是一種由Ⅱ-Ⅵ族或Ⅲ-Ⅴ族元素組成的，其中Ⅱ-Ⅵ族、Ⅲ-Ⅴ族和Ⅳ-Ⅵ族這三個系列的量子點較為常見， Ⅱ-Ⅵ族量子點由于其制備過程簡單，熒光性能優良、光學性質穩定等優勢而被廣泛用于各領域的科學研究中。

經過多年的研究和改進，量子點的合成方法正在不斷地完善。用于生物熒光標記的量子點通常采用膠體化學法來制備，按所用原料不同可分為金屬有機溶劑熱分解法和水相合成法兩種路線。水相合成法相比于金屬有機溶劑熱分解法具有試劑無毒、價格低廉、實驗操作簡單、環境友好等優勢，且水相法制備量子點無需結構修飾就具有很好的水溶性和生物相容性，這些特性使量子點能很好應用于生物成像的科學研究中。水熱法是在特制的密閉反應器（如高壓反應釜等）中，通過恒溫加熱使反應體系在高溫高壓的環境下反應生成量子點的方法。水熱法不但繼承和發展了水相法的優點，而且克服了回流法溫度不能超過100℃的缺陷，反應溫度的提高極大地縮短了量子點的制備時間。水熱法還改善了量子點表面缺陷，使量子點的熒光量子產率得到了顯著的提高。

量子點在經過適當的結構修飾后，能與細胞表面的分子或肽特異性結合，進而成功地標記靶細胞。1998年Bruchez等人首次成功使用量子點來標記固定細胞，此后經過后人的不斷研究，量子點的細胞成像技術不斷提高。將量子點引入到活細胞的方式有電穿孔技術、顯微注射法，也可以經過細胞自身的內吞作用進入到靶細胞中。量子點相比于傳統有機熒光染料具有許多優勢，它在生物醫學研究中能夠解決傳統有機熒光染料解決不了的問題，例如量子點的熒光壽命長，漂白性強，這使得用量子點標記的細胞可以在較長的一段時間內進行反復成像，實時監測細胞的動向。量子點具有生物相容性好、低毒等優點使其被廣泛應用于細胞成像的研究中。總之，量子點作為新型的熒光探針為生命醫學的細胞研究工作提供了強而有力的工具。

2 實驗部分

2.1 實驗試劑與儀器

2.1.1 實驗試劑

檸檬酸鈉（Na3C6H5O7·2H2O，上海展云化工有限公司，分析純AR）；氯化鎘（CdCl2·2.5H2O，國藥集團化學試劑有限公司，分析純AR）；硼氫化鈉（NaBH4，國藥集團化學試劑有限公司，純度96%）；亞硒酸鈉（Na2SeO3，Xiya Reagent，純度98%）；N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC，C5H9NO3S，上海阿拉丁試劑有限公司，純度99%）；羅丹明-6G（C28H31N2O3Cl，上海阿拉丁試劑有限公司）；人肝癌細胞（HepG2）（購自上海北諾生物科技有限公司）；DMEM高糖液體培養基（海克隆HyClone）；胎牛血清（FBS，浙江天杭生物科技有限公司）；青霉素鈉（C18H17N2O4SNa，biosharp）；硫酸鏈霉素（C42H84N14O36S3，biosharp）；氯化鈉（NaCl，國藥集團化學試劑有限公司，分析純AR）；氯化鉀（KCl，國藥集團化學試劑有限公司，分析純AR）；磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O，國藥集團化學試劑有限公司，分析純AR）；磷酸二氫鉀（KH2PO4，國藥集團化學試劑有限公司，分析純AR）；實驗中所用的水均為超純水。

2.1.2 實驗儀器

CP214型電子天平（奧豪斯儀器上海有限公司）；85-2型恒溫磁力攪拌器（上海司樂儀器有限公司）；DHG-9030型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海一恒科技有限公司）；LS55型熒光分光光度計（PerkinElmer珀金埃爾默企業管理（上海）有限公司）；Lambda35型紫外分光光度計（PerkinElmer珀金埃爾默企業管理（上海）有限公司）；高純N2（四川天一科技股份有限公司）；ZF-20C暗箱式自動紫外分析儀（上海寶山顧村電光儀器廠）；MF53型倒置熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

2.2 實驗方法與步驟

2.2.1 CdSe量子點的合成

（1）溶液的配制。Na2SeO3溶液的配制：稱取Na2SeO3固體0.0413 g，加5 mL超純水，所配溶液濃度為0.04 mol/L；檸檬酸鈉溶液的配制：稱取檸檬酸鈉固體0.8000 g，加8 mL超純水，配制成濃度為10%檸檬酸鈉溶液；稱取NAC固體30 mg和NaBH4固體80 mg，分別用少量超純水（<1 mL）溶解。

（2）注射法制備CdSe量子點。稱取一定量的CdCl2于50 mL的圓底燒瓶中，加入上述配置的2 mL檸檬酸鈉溶液和37 mL超純水使其混合均勻，在N2的保護下劇烈攪拌30 min。然后用微量注射器分別吸取上述配制好的全部的NaBH4、NAC和0.8 mL Na2SeO3溶液，，并將這三種溶液快速的注射到圓底燒瓶中，繼續攪拌5 min，然后將反應液轉移至高壓反應釜中，200℃反應40 min，即可得高熒光水溶性的CdSe量子點（Cd∶Se∶NAC∶NaBH4的摩爾比為1∶0.1∶0.57∶6.61，[Cd2+]=8mmol/L）。

2.2.2 CdSe量子點的細胞成像

將HepG2細胞在6孔顯微板中進行人工培養，其播種密度為每孔2×104個細胞，培養基為DMEM液體培養基，內含10%FBS和100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素。經過48 h的培育后，將培養基倒掉并用pH值為7.4的磷酸緩沖液（PBS）洗1次，然后每孔加入1 mL的固定液（醋酸∶甲醇的體積比為1∶3），5 min后將固定液的倒掉，并用PBS洗2～3次。將少量提純的CdSe量子點用PBS稀釋，并加入到6孔顯微板中。將6孔顯微板置于熒光倒置顯微鏡上，采用λ=405 nm的光激發，觀察CdSe量子點對HepG2細胞的標記情況，并拍攝熒光成像照片。

2.2.3 CdSe量子點的熒光量子產率測定

CdSe量子點的熒光量子產率采用參比法測定，以羅丹明-6G為標準物質，乙醇為溶劑，根據下面的式子計算：

3 結果與討論

量子點具有很高的比表面積，量子點的質量主要是由量子點的表面性質決定。其合成條件的改變，如反應溫度、反應時間、試劑的比例、穩定劑的類型等都會影響所制備的量子點的結構。為了得到高質量的產物，必須嚴格控制制備過程的反應條件。實驗使用熒光分光光度計來表征CdSe量子點的發光性能。在前期實驗的基礎上，控制實驗反應溫度為200℃，反應時間為40 min不變，主要研究反應物投料比以及反應物的加入順序對量子點發光性能的影響。

3.1 亞硒酸鈉的影響

實驗固定反應溫度200℃，反應時間40 min不變，不改變其他反應物的投入量，僅改變Na2SeO3的用量，探討了Cd∶Se摩爾比為1∶0.24、1∶0.15、1∶0.10、1∶0.07（[Cd2+]=8 mmol/L）對合成CdSe量子點的影響。當Cd∶Se的摩爾比為1∶0.24時，合成的CdSe量子點無熒光且有沉淀生成，推測可能是由于Se含量相對較多時，量子點表面形成了更多的Se懸鍵，懸鍵由于自身的熱力學不穩定性容易造成激子的非輻射復合而不利于量子點的發光，因此應減少Na2SeO3的投入量。如圖1所示，當Na2SeO3的摩爾比減小到0.15時，CdSe量子點開始出現微弱的熒光，進一步減小到0.10時，CdSe量子點的熒光強度顯著上升，這是因為當Se含量減少后，Cd2+-NAC復合物逐漸占據Se位點，這對量子點起到表面態鈍化作用，有利于提高CdSe量子點發光效率。但當減小至0.07時，CdSe量子點的熒光降低了，這是由于Se2 的投入量過少，進而造成Cd2+過量，過量的Cd2+會與OH-在溶液中形成CdO·nH2O沉淀，過多的沉淀吸附到量子點表面會不利于光激發。因此，本文將選取Cd∶Se的摩爾比為1∶0.10進行后續的研究。

3.2 穩定劑NAC用量的影響

穩定劑的作用在于鈍化量子點的表面缺陷，減少非輻射重組，因而其濃度是影響量子點發光性能的重要因素。固定其余條件不變，只改變NAC的量，實驗研究了Cd∶NAC的摩爾比為1∶0.48、1∶0.57、1∶0.67（[Cd2+]=8 mmol/L）時對CdSe量子點的影響。由圖2所示，隨著穩定劑NAC用量的增加，CdSe量子點的熒光強度表現出先增后降的變化趨勢，當Cd∶NAC的摩爾比為1∶0.57時合成的CdSe量子點的熒光最強。本文推測當Cd∶NAC的摩爾比為1∶0.48時，由于沒有足夠的NAC來包裹CdSe量子點而造成大量的表面缺陷，致使CdSe量子點的發光效率降低，但當Cd∶NAC的摩爾比增加大1∶0.67時，由于穩定劑NAC過多，NAC與Cd2+之間會形成更穩定的二硫配合物，游離的Cd2+減少，而未反應的Se2-濃度增大，并導致更多的表面缺陷以致于CdSe量子點的熒光下降。

3.3 硼氫化鈉的影響

在其他條件最佳的情況下，只改變的NaBH4投入量，分別考察了Cd∶NaBH4的摩爾比為1∶5.78、1∶6.61、1∶8.26（[Cd2+]=8 mmol/L）對CdSe量子點熒光強度的影響。由圖3所示，隨著NaBH4用量的增加，CdSe量子點熒光強度先增加后減小，當Cd∶NaBH4的摩爾比為1∶6.61時，CdSe量子點的熒光強度達到最大。NaBH4作為還原劑，其作用在于將亞硒酸鈉中的Se4+還原成Se2-，所以反應前體Se2-的濃度與NaBH4的用量有關。硼氫化鈉只有在合理的用量下，才能將亞硒酸鈉中的Se4+充分還原成Se2-，提高量子點的質量。

3.4 氯化鎘加入的先后順序的影響

經過前面的研究，篩選出反應物最佳的投料比為Cd∶Se∶NAC∶NaBH4的摩爾比為1∶0.1∶0.57∶6.61（[Cd2+]=8 mmol/L），固定該投料比不變，僅改變CdCl2的加入順序來研究其對合成CdSe量子點的影響。由圖4看出，CdCl2的加入順序對合成CdSe量子點的影響很大，CdSe量子點的熒光強度以及發射波長均發生了顯著地改變。因而，可以通過改變反應物的加入順序來獲得不同顏色的CdSe量子點。

3.5 最佳條件下的CdSe量子點的熒光量子產率

以羅丹明-6G為標準物質，乙醇為溶劑，采用參比法測得CdSe量子點的熒光量子產率為39%。CdSe量子點在545 nm處產生了明顯的熒光發射峰，峰型窄且對稱，說明在投料比為Cd∶Se∶NAC∶NaBH4的摩爾比為1∶0.1∶0.57∶6.61（[Cd2+]=8 mmol/L）的條件下，合成的CdSe量子點粒徑分布較均勻，在365 nm紫外光的激發下，量子點發出明亮的綠色。

3.6 CdSe量子點標記HepG2細胞

實驗采用對生物體無毒性的生物小分子NAC替代毒性較大的巰基乙酸或巰基丙酸作為量子點的穩定劑包覆在量子點的表面，使其能夠順利地侵染HepG2細胞，進行細胞成像研究。如圖5所示，被CdSe量子點標記的HepG2細胞呈明亮的綠色熒光，細胞輪廓清晰可見，說明CdSe量子點是一種很好的生物熒光成像探針。

4 結論

實驗主要對CdSe量子點的合成進行研究并將其應用于細胞成像。在量子點的合成部分，以在空氣中穩定的Na2SeO3作為硒源，NAC作為穩定劑，采用水熱法一步合成CdSe量子點，操作簡單易行。通過改變反應物的投料比以及反應物的加入順序，優化了CdSe量子點的合成條件。投料比為Cd∶Se∶NAC∶NaBH4的摩爾比為1∶0.1∶0.57∶6.61（[Cd2+]=8 mmol/L），200℃下反應40 min制備得的CdSe量子點光學特性優良、粒徑分布均勻、生物相容性好。同時本文成功地將CdSe量子點應用于HepG2細胞成像，為后續的研究奠定了堅實的基礎。

參考文獻：

[1]

游子涵. 水溶性CdSe量子點的合成及其化學/電致化學發光性質研究[D]. 武漢：華中農業大學，2007.

[2]馮啟彪. CdSe量子點的合成、表征及其應用研究[D]. 杭州：浙江大學，2006.

[3]張文豪， 丁俊生. 水溶性的高熒光CdTe/CdSeⅡ型核殼量子點的合成與表征[J]. 無機化學學報，2010（5）.

[4]張丹寧， 李定云， 孫啟壯，等. 量子點的制備方法綜述與展望[J]. 渤海大學學報（自然科學版），2012（2）.

[5]Bruchez M， Moronne M， Gin P， et al. Semiconductor nanocrystals as fluorescent biological labels[J]. Science， 1998， 281（38）：2013～2016.

[6]楊玉霞. 量子點在細胞內成像中的應用進展研究[J]. 大家健康（學術版），2014（16）.

[7]秦海燕. 納米晶的光學性質及其細胞成像和單分子示蹤應用[D].杭州：浙江大學，2012

[8]黃 亮. Ⅱ-Ⅵ族量子點及其二氧化硅復合納米結構的制備與生物成像應用[D]. 武漢：華中農業大學，2013.

[9]王益林，楊 昆，潘華橋，等. 高質量CdSe量子點的水相制備與表征[J]. 高等學校化學報，2012（12）.

[10]Wei C， Li J， Gao F， et al. One-step synthesis of high-quality water-soluble CdSe quantum dots capped by N-acetyl-L-cysteine via hydrothermal method and their characterization[J]. Journal of Spectroscopy， 2015（13）.

[11]譚 華，倪朕伊，皮孝東，等. 硅量子點在光電器件中的應用研究進展[J]. 激光與光電子學進展， 2017（3）.

[12]于 璇.量子點電視：進擊的“寵兒”[J]. 電器， 2015（2）.

[13]喬 毅，馮雪元，張家雨，等.量子點發光材料在多色照明上的應用[J]. 照明工程學報，2006（1）.

[14]李文杰，鐘新華. 預先合成量子點組裝制備高效量子點太陽電池[J]. 物理學報，2015（3）.

[15]馬 娟，宋鳳丹，陳 昊，等. 量子點敏化太陽能電池研究進展[J]. 化工進展， 2015（10）.

[16]張向東，尹世忠. 電磁場下量子點中的電子態[J]. 河北師范大學學報，1996（2）.

[17]馮志芳.電子在三個耦合量子點中輸運的主方程[J]. 和田師范專科學校學報， 2005（5）.

[18]鄭皓源.量子點敏化太陽能電池研究進展[J]. 化工技術與開發，2015（3）.

[19]李玉現，劉建軍，李伯臧. 量子點接觸中的電導與熱功率：磁場與溫度的影響[J]. 物理學報，2005（3）.

[20] 閉偉鑫，王志亮，李 穎，等. 油溶性及水溶性碳量子點敏化太陽能電池性能[J].南通大學學報（自然科學版），2014（2）.

[21]張太宏，云斯寧，李 晶，等. 染料敏化太陽能電池合金對電極材料[J]. 科學通報， 2016（Z1）.

[22]白宇冰，王秋瑩，呂瑞濤，等. 鈣鈦礦太陽能電池研究進展[J]. 科學通報， 2016（Z1）.

[23]靳斌斌. 量子點敏化太陽電池光陽極研究進展[J]. 當代化工. 2016（2）.

[24]何章凱，王多發，陳高玲，等. 量子點敏化太陽能電池TiO2光陽極研究進展[J]. 材料導報， 2016（3）.

[25]梅海林，唐立丹，王 冰，等. 鈣鈦礦型太陽能電池的研究進展[J]. 遼寧工業大學學報（自然科學版）， 2016（1）.

[26] 朱立峰，石將建，李冬梅，等. 多孔TiO2層厚度對鈣鈦礦太陽能電池性能的影響[J]. 化學學報， 2015（3）.

[27]鄭皓源. 量子點敏化太陽能電池研究進展[J]. 化工技術與開發， 2015（3）.

[28]張秀清，李艷紅，張 超. 太陽能電池研究進展[J]. 中國材料進展， 2014（7）.

[29]楊健茂，胡向華，田啟威，等. 量子點敏化太陽能電池研究進展[J]. 材料導報， 2011（23）.

[30]于哲勛，李冬梅，秦 達，等.染料敏化太陽能電池的研究與發展現狀[J]. 中國材料進展， 2009（Z1）.