龍血素B對牛蛙坐骨神經干興奮傳導的影響

馬鵬飛++潘鑫鑫++萬瑩++陳素

摘要：為研究龍血竭的有效成分龍血素B對牛蛙坐骨神經-腓腸肌的影響，采用不同濃度的龍血素B作用于牛蛙坐骨神經-腓腸肌標本，觀察和分析了給藥前后坐骨神經-腓腸肌最大收縮幅值。研究結果表明：不同濃度的龍血素B單體均能抑制坐骨神經-腓腸肌的最大收縮幅值，抑制率隨著藥物濃度增加而加強，到0.25 mg/mL濃度時達到最大抑制效果。龍血素B可能是通過影響坐骨神經干上的電壓門控鈉離子通道，進而影響坐骨神經干上動作電位的產生和傳遞，抑制腓腸肌的收縮。

關鍵詞：龍血素B；坐骨神經；電壓門控鈉離子通道；動作電位

中圖分類號：R337.3

文獻標識碼：A 文章編號：16749944（2017）10021503

1 引言

龍血竭是百合科植物劍葉龍血樹的紅色樹脂，作為傳統名貴民族藥物，具有活血化瘀、定痛止血、斂創生肌等功效[1]，普遍認為龍血竭的有效成分為一類黃酮類化合物，其中龍血素B是鑒別龍血竭的指標性成分[2]。以往的電生理實驗指出龍血竭是通過調制背根神經節上的電壓門控鈉離子通道影響痛覺信號的傳入起到鎮痛的作用，并且龍血素B等黃酮類物質是調制電壓門控鈉離子通道的主要作用因子[3]，而并不清楚龍血素B在組織中的鎮痛效果和作用方式。酰胺類局麻藥通過可逆結合電壓門控鈉離子通道阻滯鈉離子內流從而抑制動作電位產生引起局部肌肉麻醉的機制[4]提供了一個可行的研究方案。本研究采用不同濃度的龍血素B溶液作用牛蛙坐骨神經-腓腸肌標本，利用生物機能實驗系統采集坐骨神經-腓腸肌不同時間點的最大收縮幅值并進行分析，間接證明龍血素B對牛蛙外周神經興奮傳導的調制效果以驗證其在組織中的作用效果是否與在細胞實驗中具有一致性。

2 材料和方法

2.1 實驗動物

牛蛙，不限雌雄，體重270±10 g，購買于湖北省實驗動物中心。

2.2 實驗儀器

四川泰盟科技BL-420E生物機能實驗系統，肌張力換能器，刺激電極，神經標本屏蔽盒。

2.3 實驗藥品

實驗中使用的龍血素B由廣西壯族自治區中醫藥研究所提供，盧文杰教授鑒定。實驗中按照一般實驗溶液配制方法，將龍血素B加入任氏液中配制成不同濃度的溶液備用。溶液質量濃度分別為0.01 mg/mL、0.05 mg/mL、0.25 mg/mL、0.1 mg/mL、0.5 mg/mL。

2.4 實驗方法

將實驗用牛蛙按照常規方法制備成坐骨神經-腓腸肌標本，室溫浸泡在任氏液中15min穩定后使用，神經肌肉標本隨機分成6組，每組5條，神經干放置于肌槽上屏蔽盒中，坐骨神經端接入露絲刺激電極，每組神經干分別將坐骨神經端浸于任氏液中（空白對照）以及5種不同濃度溶液中，腓腸肌跟腱用扎線與肌張力換能器連接，連接后刺激測試初始肌張力，調整扎線松緊，確保每組初始肌張力值無明顯差異。選擇實驗項目為刺激強度與反應的關系，將初始刺激強度設置為0 mV，增幅設置為5 mV，僅用任氏液浸泡坐骨神經干，進行刺激，記錄0時刻和給藥后5 min腓腸肌收縮曲線隨后每2 min進行一次記錄，直至33min共記錄15個時間點收縮曲線，共記錄5個標本，以觀察時間對牛蛙坐骨神經-腓腸肌最大收縮幅值的影響；后將浸泡液換為質量濃度分別0.01 mg/mL、0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL龍血素B溶液進行同樣的刺激，觀察給藥前后各時間點最大收縮幅值，記錄龍血素B溶液浸泡牛蛙坐骨神經干前后的坐骨神經-腓腸肌最大收縮幅值，以觀察30 min以上仍收縮良好的坐骨神經-腓腸肌標本記錄為有效記錄。每種濃度的龍血素B溶液浸泡后藥理效應的有效記錄為5個標本。

2.5 數據分析和曲線擬合

2.5.1 數據分析

運用BL-420E生物機能實驗系統中自帶的測量功能在得到的收縮曲線上采集數據，獲得每條曲線收縮最大幅值、最大刺激強度（產生收縮最大幅值時的刺激電壓強度）以及閾刺激強度（肌肉開始收縮時的電壓強度）。由于空白對照組收縮最大幅值、最大刺激強度、閾刺激強度在各時間點所得數據與0時刻三種數據值比較無顯著性差異，將各時間點數據以0時刻數據作為標準進行歸一化處理，使用歸一化處理后的數值進行分析。同一濃度不同時刻數據用mean±sd表示，使用配對t檢驗和單因素方差分析進行檢驗，P<0.05作為顯著性檢驗的標準，所有數據使用SPSS分析，igor pro作圖。

2.5.2 曲線擬合

（1）藥物坐骨神經藥物濃度依耐性。藥物對腓腸肌最大收縮幅值肌張力的百分比抑制率（Inhibition%）用式（1）表示：

（2）藥物對坐骨神經組織中作用方式分析。在本實驗室之前的細胞實驗中發現，龍血素B對DRG細胞膜上的電壓門控鈉離子通道作用方式符合受體學說，因為動作電位的產生主要由鈉離子內流形成，因此猜測龍血素B影響牛蛙坐骨神經干動作電位產生和傳遞也應該具有相同的藥物作用方式，在此以藥物對牛蛙坐骨神經-腓腸肌最大收縮幅值的抑制率來描述藥物的藥理效應，因此藥物在某一時刻t對牛蛙坐骨神經-腓腸肌最大收縮幅值的抑制率Et為：

式（3）中，藥物分子的量用L表示，t為時間，k1和k2分別為藥物的結合與解離常數。用式（3）對藥物作用牛蛙坐骨神經干的時效曲線進行擬合。

曲線擬合的卡方擬合優度檢驗以P<0.05作為顯著性檢驗的標準。

3 結果分析

3.1 龍血素B對牛蛙坐骨神經-腓腸肌最大收縮幅值的抑制效應

對未加入藥物的腓腸肌最大收縮幅值進行歸一化處理，并以各時刻值與初始時刻值進行配對t檢驗，結果顯示各時刻P>0.05，最大收縮幅值隨時間變化的曲線見圖1。0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL的龍血素B溶液對骨骼肌的最大收縮幅值均具有抑制作用，最大抑制率分別為43±12.25%、58±2.82%、74±9.49%、73±3.39%。龍血素B對牛蛙坐骨神經最大收縮幅值的半效抑制濃度（IC50）為0.034 mg/mL（圖2，3）。

3.2 龍血素B對牛蛙坐骨神經-腓腸肌最大收縮幅值時效

將0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.25 mg/mL這3個濃度龍血素B浸泡后各時間點的最大收縮幅值以加藥前最大收縮幅值為1進行歸一化處理，并計算抑制率。結果顯示0.05 mg/mL龍血素B處理后最大收縮幅值抑制率從距加藥19 min時間點開始每個時間點均具有顯著性差異，P<0.05；0.1 mg/mL龍血素B處理后最大收縮幅值抑制率從距加藥5 min開始每個時間點均具有顯著性差異，P<0.01；0.25 mg/mL龍血素B處理后最大收縮幅值抑制率從距加藥7 min開始各時間點均具有顯著性差異，P<0.01。這說明3種濃度的龍血素B溶液對牛蛙坐骨神經-腓腸肌最大收縮幅值的抑制率隨時間而變化。

為了驗證龍血素B作用于神經組織是否與作用于細胞一樣，符合受體學說，以加藥時間點為橫坐標，加藥后11 min各時間點龍血素B對牛蛙坐骨神經-腓腸肌最大收縮幅值的抑制率為縱坐標，作0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.25 mg/mL三種濃度龍血素B抑制作用隨時間變化的散點圖，用式（3）對散點圖進行擬合，作卡方擬合優度檢驗，結果顯示三個濃度擬合結果P>0.05，3種濃度龍血素B的時效曲線擬合見圖4。

4 結論

以往在大鼠，DRG細胞上的電生理實驗表明，龍血竭及其藥效物質龍血素B對初級感覺神經元上的電壓門控的鈉離子通道具有調制作用[3]，DRG細胞上的電壓門控鈉電流也被認為是引起其膜電位去極化的最初離子流[5]對其產生動作電位具有重要意義。在解剖學上，牛蛙的坐骨神經干連接外周神經，可將中樞神經產生的動作電位傳遞至外周神經進而通過神經肌肉接頭，引起骨骼肌內質網的Ca2+釋放最終引起骨骼肌收縮[6]。也有很多研究表明坐骨神經結扎的病理性痛覺模型會引起DRG神經元上電壓門控鈉離子通道的改變[7]，可見初級感覺神經元細胞上的電壓門控鈉離子通道是影響外周神經傳導的重要因素。本實驗正是通過測量和分析龍血素B嚴格作用坐骨神經干后坐骨神經-腓腸肌最大收縮幅值的變化，從而間接地獲取龍血素B作用神經干后對神經干中動作電位產生和傳導的影響的信息，以探明龍血素B作用于神經組織后是否與龍血素B作用于DRG細胞細胞膜上的電壓門控鈉離子通道具有一致的作用效果和作用方式。

研究結果表明：龍血素B對牛蛙坐骨神經最大幅值的抑制與以往在DRG細胞上進行的電生理實驗中龍血素B所表現的對電壓門控鈉離子通道電流峰值抑制的濃度依耐性關系基本一致[3，8]，但是龍血素B作用于DRG細胞對TTX-s型鈉離子通道電流的半效抑制濃度約為0.01 mmol/L[8]，而龍血素B溶液作用于神經干引起坐骨神經-腓腸肌最大收縮幅度抑制的半效抑制濃度為0.034 mg/mL，這一濃度遠大于龍血素B作用于DRG細胞時對鈉電流峰值的半效抑制摩爾濃度。并且有趣的是龍血素B作用于組織時，不同濃度溶液浸泡坐骨神經干所表現的藥物作用方式與推測并不一致，龍血素B的結合常數和解離常數在高濃度（0.25 mg/mL）溶液作用時相較于中等濃度（0.1 mg/mL）和低濃度（0.05 mg/mL）均表現出了明顯的升高，這說明龍血素B在高濃度作用神經組織時能更有效地結合組織中神經細胞上的電壓門控鈉離子通道同時也更容易從神經細胞上解離。這可能是由于坐骨神經干是一個相對復雜的組織，由膠質細胞、組織液和多種具有不同生理特性的神經纖維構成，構成神經纖維的神經細胞也各不相同，藥物作用于坐骨神經干時要經過一個浸潤的過程才能到達目標細胞進而調制細胞膜上的電壓門控鈉離子通道，龍血素B在組織中的具體作用機制并不清楚，需要進一步的研究。

參考文獻：

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