氣相色譜—質譜法檢測肉制品中的殺鼠酮

賀 燕

徐文泱

孫桂芳

周興旺

唐萬里

(湖南省食品質量監督檢驗研究院，湖南 長沙 410017)

氣相色譜—質譜法檢測肉制品中的殺鼠酮

賀 燕

徐文泱

孫桂芳

周興旺

唐萬里

(湖南省食品質量監督檢驗研究院，湖南 長沙 410017)

建立了氣相色譜—質譜法測定肉制品中殺鼠酮的方法。考察了不同的提取及凈化方式對檢測結果的影響。試樣經丙酮—正己烷超聲提取，采用一種新型分散固相萃取管進行凈化，采用EI源以氣相色譜質譜法進行檢測。添標水平為0.5～5.0 mg/kg時平均回收率為81%～89%，相對標準偏差為3.0%～8.4%，殺鼠酮檢出限為0.005 mg/kg，該方法快速、簡單且靈敏度高，符合檢測方法參數的確認要求。

氣相色譜—質譜法；殺鼠酮；肉制品；檢測

近年來，由誤食鼠藥引發的食品安全事故屢有發生。殺鼠酮是一種抗凝血類殺鼠劑[1-2]，其母體結構為茚滿二酮[3]，其作用機制是競爭性抑制維生素K1，影響凝血因子在肝臟內的合成，使凝血時間延長，導致出血[4]。殺鼠酮見效快，對人的毒性和殘留較小，因此被廣泛使用，目前這種鼠藥未有任何國家、地方標準或較為系統通用的定性定量檢測方法。對此類鼠藥檢測的相關文獻[4-7]報道主要針對一些生物樣本，特點是基質簡單，雜質干擾少，對樣品的處理較為簡單，基本無需采取進一步的凈化手段，但對脂肪含量較多或組成成分復雜的食品尚未涉及，因此對其建立食品中的檢測方法十分必要。

謝維平等[8]以QuEChERS方法對血漿中的抗凝血滅鼠劑進行凈化，其加標回收率為70.4%～101.5%。黃克建等[9]以乙腈沉淀樣品中的蛋白質，稀釋、離心后直接進樣，建立了同時測定全血和尿液樣品中7種抗凝血殺鼠藥的在線固相萃取/液相色譜—線性離子阱質譜分析方法。

抗凝血殺鼠藥的檢測方法以液相色譜[10-13]及液相色譜—質譜法[14-16]為多，Virginie Vandenbroucke等[6]采用LC-HESI-MS/MS(液相色譜—加熱電噴霧電離串聯質譜)方法檢測肝臟中的8種抗凝血殺鼠藥成分，檢出限最低可達0.37 ng/g(殺鼠靈);陳曉紅等[5, 17-18]致力于離子色譜質譜檢測多種鼠藥的方法;謝珍茗等[19]以α-溴苯乙酮酯為衍生化試劑，建立了柱前衍生—高效液相色譜法測定生物檢材中的氟乙酸鈉。前處理方法主要有QuEChers凈化[8, 20]、SPE[21]、液液萃取[7]等。食品中對鼠藥的氣相色譜—質譜法鮮有建立。氣相色譜—質譜法是一種常用的檢測食品中有害物質的儀器方法，檢測分子量小，沸點低且熱穩定性好的化學物質有較強優勢[22-24]。本研究擬以氣相色譜—質譜法建立脂肪含量較多的肉制品中殺鼠酮的檢測方法，為中毒案(事)件的殺鼠酮的快速篩查提供技術支撐，提高食品安全風險監測能力及突發事件應急處置能力，填補監測空白。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

殺鼠酮：99.8%，北京壇墨質檢科技有限公司；

乙腈、丙酮、正己烷：色譜純，德國Merck公司；

二氯甲烷：色譜純，上海安譜科學儀器有限公司；

石油醚、氯化鈉：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

增強性去脂質凈化管：5982-0101，美國Agilent公司；

FLORISIL柱、NH2小柱：500 mg/6 mL，上海安譜科學儀器有限公司；

色譜柱：HP-5 MS型，60 m×0.25 μm×0.25 mm，美國Agilent公司。

1.2 儀器與設備

氣相色譜-質譜聯用儀：Agilent 7890A 5975C-MSD型，美國安捷倫科技有限公司；

離心機：Centrifuge 5804R型，德國艾本德股份公司；

超聲波清洗器：KQ-500DE型，昆山美美超聲儀器有限公司；

旋轉蒸發儀：RE-52AA型，上海亞榮生化儀器廠；

分析天平：SPS401F型，奧豪斯儀器(上海)有限公司；

數顯型多管旋渦混合器：945066型，上海安譜科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱：HP-5 MS；程序升溫條件：60 ℃保持1 min，20 ℃/min到180 ℃保持 6 min，10 ℃/min到280 ℃保持8 min；進樣口：220 ℃；分流方式：不分流。

1.3.2 質譜條件 離子源為電子轟擊離子(EI)源，電子轟擊能量為70 eV，離子源溫度為230 ℃，四極桿溫度為150 ℃，分別采用全掃描SCAN和選擇離子SIM模式，溶劑延遲時間為5 min。

1.3.3 樣品萃取條件優化 選取丙酮—正己烷(體積比1∶1)、乙腈、石油醚、石油醚—丙酮(體積比1∶1)、二氯甲烷、乙腈—甲苯(體積比3∶1)為提取溶劑。按1.3.4中的方法一進行處理后，以GC-MS進行分析，計算回收率。

1.3.4 樣品凈化條件優化 試驗考察了3種較為常見的正相固相萃取小柱[NH2柱、FLORISIL柱、PSA(脂質增強)柱]對加標樣品香腸和生豬肉進行凈化，考察了3種萃取柱對目標物回收率的影響。具體方法：

(1) 稱取5 g樣品，酌情加入少量水及NaCl，靜置10 min。加入25 mL丙酮—正己烷(體積比1∶1)超聲提取20 min。離心并提取上清液。將上述步驟重復后對上清液進行收集，用旋轉蒸發儀將其于45 ℃濃縮，以丙酮定容至2 mL，轉移至增強型脂質去除凈化管中，渦混后離心取上清液上機。

(2) 稱取5 g樣品，酌情加入少量水及NaCl，靜置10 min。加入25 mL丙酮—正己烷(體積比1∶1)超聲提取20 min。離心并提取上清液。將上述步驟重復后對上清液進行收集，用旋轉蒸發儀將其于45 ℃濃縮，分3次共加入12 mL丙酮—正己烷(體積比1∶1)，并以活化后的NH2小柱凈化。收集洗脫液，濃縮后定容上機。

(3) 稱取5 g樣品，酌情加入少量水及NaCl，靜置10 min。加入25 mL丙酮—正己烷(體積比1∶1)超聲提取20 min。離心并提取上清液。將上述步驟重復后對上清液進行收集，用旋轉蒸發儀將其于45 ℃濃縮，分3次共加入12 mL丙酮—正己烷(體積比1∶1)，以活化后的FLORISIL小柱凈化。收集洗脫液，濃縮后定容上機。

2 結果與分析

2.1 樣品提取溶劑的選擇

在提取過程中，提取溶劑的選擇對殺鼠酮提取效率的影響較大。由于肉制品的蛋白、油脂含量較高，基體雜質干擾大，因此試驗中選擇的溶劑應對油脂類大分子的提取效率影響小。由表1可知，丙酮—正己烷(體積比1∶1)為提取溶劑時，目標物的回收率和重現性較好。丙酮沸點較低，可保證減壓濃縮過程快速、順利地進行，由于處理溫度較低也防止了殺鼠酮的揮發。選取極性較低的混合溶劑可使得部分干擾物與目標物分離，有利于樣品的凈化和回收率的提高。乙腈—甲苯(體積比3∶1)的提取效率最低，可能是此混合溶劑對基質中雜質的提取效果較好，降低了儀器的靈敏度。進一步考察超聲提取、索氏提取、振蕩提取、均質提取4種常見的提取方式對提取效率的影響，結果表明4種提取方式對結果的影響接近，由于超聲提取操作簡單，故選擇該提取方式。分別比較了超聲提取次數為1，2，3次及超聲時間為5，20，45 min對提取效率的影響，確立超聲時間20 min、提取次數2次即可達到理想的提取效率。

表1 不同提取溶劑提取加標肉制品中殺鼠酮的平均回收率和相對標準偏差

Table 1 Average recoveries and RSD of pindone in spiked meat products with different solvents (n=6) %

2.2 凈化方法的選擇

固相萃取相比其他的凈化方法，其優勢在于處理簡單，凈化效果較好。因此，被廣泛應用于農殘獸殘的前處理。其選擇主要取決于樣品基質及目標物的性質。殺鼠酮為中等極性化合物。肉制品中的雜質較多，比較適合正相固相萃取。通過對回收率的比較，發現FLORISIL小柱的凈化效果最差，回收率僅為59%，NH2小柱凈化對香腸中殺鼠酮的回收率為58%；采用PSA柱兩類肉制品的回收率可達到81%以上，對于脂類物質的凈化效果較好。因此試驗采用PSA柱凈化。PSA柱是弱陰離子交換吸附劑，可有效去除樣品中的極性色素、糖類、有機酸、脂肪酸及可形成氫鍵的組成成分。此外，在凈化前，將提取液置于冰箱中冷凍1 h，使油脂類物質盡量分離，降低對色譜柱的污染，回收率有明顯提高。不同固相萃取小柱或凈化管對肉制品中殺鼠酮回收率的影響見圖1。

2.3 基質效應的考察

基體對待測組分的影響稱為基質效應。常用的校準曲線測量只在基質效應不影響測定結果時才能使用。以2.2凈化條件處理空白試樣，并得到洗脫溶劑。用洗脫溶劑配制一系列標準溶液，通過基質匹配校準曲線的斜率/溶劑標準曲線的斜率考察化合物的基質效應。對樣品在儀器上的信號值進行考察，結果顯示，空白基質配制溶液信號值遠遠低于洗脫溶劑配制的同一濃度標準溶液，由此可得，方法基質效應顯著，標準溶液宜用空白基質溶液配制。

圖1 凈化方式對肉制品中殺鼠酮回收率的影響Figure 1 The effects of purification methods on pindone in meat products

2.4 儀器條件的優化

殺鼠酮為中等極性化合物，采用HP-5 MS色譜柱進行雜質的分離。其沸點不高，出峰時間較早。待測物出峰后再設置較快升溫程序使雜質不在色譜柱中滯留，雜質逐漸與色譜柱固定相分離，避免色譜柱污染。

將標準溶液在掃描模式下進行測定，確定其質譜結構信息和保留時間，選擇豐度高、碎片質量較大、干擾少的離子作為定量和定性離子。樣品測定時，如滿足以下條件則判斷樣品為陽性結果：① 色譜峰的保留時間與標準樣品色譜峰的保留時間一致，且偏差在±2.5%之內；② 所選擇的監測離子均出現；③ 離子豐度比符合表2要求。

表2 定性測定時相對離子豐度的最大允許偏差Table 2 Selective ion and relative abundance ratio for target determination %

標準物質及加標樣品的TIC圖及SIM圖見圖2～5。由圖2～5可知，加標樣品的色譜圖峰形良好，無雜質干擾。說明此儀器方法條件的適用性較好。

2.5 線性范圍和檢出限

在優化條件下，以質量濃度為橫坐標，響應值為縱坐標繪制標準工作曲線。結果表明，標準曲線線性方程為y=1.02×105x-3.24×104，在質量濃度為0.05～20.00 μg/mL時，標準曲線線性關系良好，相關系數均>0.99。以3倍信噪比計算檢出限，得檢出限為0.005 mg/kg。

2.6 回收率和精密度

在空白樣品中，添加低、中、高3個濃度水平的標準溶液進行加標回收率測定，每水平做6組平行。由表3可知，各組分測定結果的相對標準偏差在3.0%～8.4%，空白加標回收率為81%～89%，滿足GB/T 27404—2008對方法技術參數的相關要求。

圖2 標準物質殺鼠酮的TIC圖Figure 2 Total ionic chromatogram of standard reference

圖3 標準物質殺鼠酮的SIM圖Figure 3 Selected ion monitoring chromatogram of pindone

圖4 標準物質殺鼠酮的SCAN圖Figure 4 SCAN chromatogram of pindone

圖5 加入殺鼠酮的肉制品TIC圖Figure 5 Total ionic chromatogram of pindone-spiked sample

3 結論

本試驗通過對前處理方式及色譜條件的優化，建立了肉制品中殺鼠酮的氣相色譜-質譜聯用檢測方法，對樣品的提取及凈化方法均進行了研究，并確立了精密度、檢出限、回收率等技術參數，研究結果表明，該方法快速簡單、準確可靠、符合殘留檢測的要求，為快速檢測提供了簡便的樣品前處理方法和分析手段。

圖6 殺鼠酮標準曲線Figure 6 Standard curve of pindone表3 加標回收率及精密度一覽表Table 3 Recoveries of different spiked levels and relative standard deviation

樣品加入量/(mg·kg-1)平均回收率/%RSD/%0.5828.4香腸1.0887.75.0878.20.5817.4臘肉1.0867.25.0896.90.5827.4火腿1.0813.05.0855.2

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Determination of pindone in meat product by GC-MS

HEYan

XUWen-yang

SUNGui-fang

ZHOUXing-wang

TANGWan-li

(HunanResearchInstituteofFoodQualitySupervisionandInspection,Changsha,Hunan410017,China)

To establish a GC-MS method for determination of pindone in meat products. The effects of ways of extraction and purification on the recovery have been studied. The samples were extracted by acetone and (hexane 1∶1) with dSPE purified column. GC-MS was used for determination by EI. The average recoveries were in the range of 81%～89% at spiked levels of 0.5～5.0 mg/kg. The relative standard deviation of the methods were 3.0%～8.4%, and the limit of quantification reached 0.005 mg/kg which meet the requirement of technical parameters for analysis with fast and simple determination and high sensitivity.

GC-MS; pindone; meat products; determination

湖南省食品藥品安全科技項目(編號：湘食藥科R201608)

賀燕(1982—)，女，湖南省食品質量監督檢驗研究院工程師，碩士。E-mail:45023091@qq.com

2017—04—01

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.05.020