電化學法測量黑曲霉孢子萌發過程中葡萄糖氧化酶的活性

劉洋汝

李忠海1,2

任佳麗1, 2

(1. 中南林業科技大學食品科學與工程學院，湖南 長沙 410004；2. 稻谷及副產品深加工國家工程實驗室，湖南 長沙 410004)

電化學法測量黑曲霉孢子萌發過程中葡萄糖氧化酶的活性

劉洋汝1

李忠海1,2

任佳麗1, 2

(1. 中南林業科技大學食品科學與工程學院，湖南 長沙 410004；2. 稻谷及副產品深加工國家工程實驗室，湖南 長沙 410004)

建立了電化學循環伏安法測定葡萄糖氧化酶活性的方法。該方法引入二茂鐵甲醇作為氧化還原探針，以玻碳電極作為工作電極、飽和甘汞電極作為參比電極、鉑絲電極作為輔助電極，采用循環伏安法，得到不同酶活的峰電流值，在酶濃度為0.128～2.377 U/mL，酶濃度與峰電流之間存在線性關系，相關系數為0.998，檢測下限為0.128 U/mL。運用該法測定了孢子萌發過程中酶活的變化，隨著孢子的萌發，酶活先增加，達到最大值(2.130 U/mL)后再次下降，同時采用傳統滴定法進行對照。結果表明，相較于傳統方法，電化學方法具有準確、快速和簡便的特點。

孢子；萌發；葡萄糖氧化酶；循環伏安法

葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase，GOD)是一種需氧脫氫酶，能高度專一地氧化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和過氧化氫，在食品、畜牧以及生物醫藥等領域有著廣泛的應用[1-2]。目前工業中生產葡萄糖氧化酶常采用黑曲酶整菌發酵法[3]，該方法生產的游離GOD存在穩定性差、易變性失活、酶與底物難以分離等缺陷，不利于產物的回收與連續生產[4-5]。S. Ramachandran等[6-7]研究發現黑曲霉孢子是一個葡萄糖氧化酶的貯存庫，并通過檸檬醛透化孢子膜，抑制孢子萌發，使孢子催化活力增長到1.500～4.350 g/(L·h)。Moksia等[8]證明黑曲霉孢子具有一個充滿活力的酶催化體系，孢子本身也可以起到良好的酶固定作用，可作為GOD生物催化劑進行開發。目前，對于黑曲霉孢子的研究主要集中在發酵葡萄糖產酸能力[6-10]，然而黑曲霉孢子在哪個階段的葡萄糖氧化酶酶活力最強，尚未進行系統研究。

目前，國內外檢測葡萄糖氧化酶酶活力主要采用滴定法和分光光度法，但是這兩種方法測量精度低，操作繁瑣，耗時較長。電化學方法具有靈敏度高、響應速度快、操作簡便等優勢，是研究生物化學和生物活動的一種新方法。由于酶在電極表面的取向往往不利于其電活性基團與電極之間的電子交換，與電極間的直接電子轉移受到阻礙，通過電化學檢測酶活力歷來是一個令人困擾的問題。本試驗擬以二茂鐵甲醇(Ferrocene methanol，Fc)為氧化還原介質，介導酶與電極間的電子傳遞，玻碳電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，掃描得到循環伏安曲線，然后將獲得的陽極峰電流與酶濃度進行線性回歸，以期實現對葡萄糖氧化酶活力的檢測。

1 材料與方法

1.1 菌種

黑曲霉 (Aspergillusniger) NRRL3：美國ATCC公司。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 材料與試劑

葡萄糖：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

吐溫-80：化學純，國藥集團化學試劑有限公司；

二茂鐵甲醇：216.060 g/mol， 西格瑪奧德里奇公司；

葡萄糖氧化酶：228 253 U/g，西格瑪奧德里奇公司；

檸檬醛：95%，美國西格瑪奧德里奇公司；

斜面培養基：馬鈴薯培養基，稱取 200 g馬鈴薯，加水煮爛，紗布過濾，加入15 g瓊脂、20 g葡萄糖，補足水分至 1 000 mL，分裝試管，加塞、包扎，121 ℃滅菌20 min；

固態發酵培養基：蕎麥種子培養基，稱量300 g 市售蕎麥種子，蒸餾水洗兩次，加等量的蒸餾水沸水浴15 min，過濾，分裝錐形瓶，加塞、包扎，高壓蒸氣滅菌處理，得到50 g水/100 g的蕎麥種子培養基[4]。

1.2.2 主要儀器設備

電化學工作站：660D型，上海辰華儀器有限公司；

雙面凈化工作臺：SW-CJ-2F型，蘇州凈化設備有限公司；

霉菌培養箱：MJX-150BⅢ型，北京中興偉業儀器有限公司；

冷凍離心機：TK25KG型，長沙東旺儀器有限公司；

生物顯微鏡：BM-1000型，致微儀器有限公司；

高壓滅菌鍋：GI54DWS型，致微儀器有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：DK-98型，天津市泰斯特儀器有限公司；

超純水機：LS1-10型，湖南中沃水務環保科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 黑曲霉孢子種子液的制備 從冰箱取出凍存黑曲霉孢子液，室溫融化后轉接斜面培養基，置于恒溫箱 28 ℃培養7 d。用含有0.1 mL/100 mL 吐溫-80 的滅菌蒸餾水沖洗斜面，收集孢子懸液至離心管，4 ℃ 10 000×g 離心10 min，棄上清液，收集孢子沉淀。稀釋沉淀，在顯微鏡下用血球計數板計數，調整孢子懸液濃度108spores/mL。

取1 mL 108spores/mL的孢子懸液于100 g蕎麥種子培養基中，28 ℃培養200 h，然后加入0.1 mL/100 mL 吐溫-80 的滅菌蒸餾水，180 r/min 振搖1 h后，過濾，收集濾液，4 ℃ 10 000×g 離心10 min，棄掉上清液，收集沉淀，確定109spores/mL 濃度的孢子種子液備用。以上操作均在無菌條件下進行。

1.3.2 標準曲線的繪制

(1) 電極預處理：以玻碳電極( GC，Φ= 2 mm) 為工作電極，用 0. 050 μm氧化鋁兌水打磨拋光至鏡面，依次用無水乙醇、蒸餾水超聲清洗1 min 后，晾干備用。飽和甘汞電極(SCE)作為參比電極, 鉑絲電極作為輔助電極。

(2) 酶濃度的測量：往電解池中加入100 μL 4 g/L 葡萄糖溶液，800 μL 1 mmol/L二茂鐵甲醇的0.1 mol/L的磷酸鉀緩沖液(pH=7.0)，30 ℃水浴5 min，然后依次加入100 μL濃度為0.000，1.282，5.128，10.256，15.384，23.770 U/mL的葡萄糖氧化酶，設定電壓范圍0.0～0.5 V，掃速0.1 V/s，作循環伏安掃描。記錄每一個酶濃度所對應的峰電流值，并繪制成標準曲線，計算得到相應的線性回歸方程。

1.3.3 黑曲霉孢子萌發觀察 接種1 mL 109spores/mL孢子種子液至含25 mL基本培養基[11]的錐形瓶中，在96孔板上每孔定時加入200 μL 孢子培養液，置于30 ℃恒溫培養箱中。定時取孢子培養液涂布于載玻片，觀察[12-13]并計數100～200個孢子，以長出的芽管長度達到2倍原孢子長度為萌發標準[14]，計算孢子萌發率，之后每隔2 h 觀察，持續24 h，觀察黑曲霉孢子萌發狀況。

1.3.4 黑曲霉孢子生長過程中的酶活測定 用移液槍吸取1 mL 109spores/mL 孢子種子液于含25 mL 基本培養基的錐形瓶中，在96孔板上每孔分別在0，2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24 h加入200 μL 孢子培養液，30 ℃恒溫培養，每組3個平行。取對應時間的黑曲霉孢子培養液100 μL，按照標準曲線檢測方法進行測試，將得到的峰電流值代入到標準曲線對應的線性回歸方程中，計算得到黑曲霉孢子在休眠、萌發、菌絲生長階段的酶活信息。取適量孢子培養液80 ℃滅活30 min，循環伏安掃描，作為空白組。

1.3.5 對比試驗 選用滴定法：取1 mL梯度稀釋酶液加入到已經30 ℃恒溫5 min，25 mL含4 g/L葡萄糖的60 mmol/L (pH=5.6)的乙酸鈉緩沖液中。加入20 mL 0.1 mol/L的NaOH中停止反應。將所得混合物通過使用0.1 mol/L標準HCl溶液滴定，酚酞作為指示劑至暗粉色為終點。所加鹽酸的體積為V。空白測定(孢子溶液不存在)在相同的試驗條件下進行。添加的標準HCl的體積為V0。葡萄糖酸的濃度可由式(1)計算，酶活由式(2)計算，一個酶活單位為在1 min內能轉化1 μmol底物的酶量。

(1)

(2)

式中：

C——葡萄糖酸的濃度，μmol/mL；

E——酶活，μmol/(mL·min)；

N——標準 HCl 溶液的摩爾濃度，mol/L；

V0——空白滴定的標準HCl的體積，mL；

V——最終滴定鹽酸的體積，mL；

H——樣品反應時間，min。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖氧化酶活性電化學測定方法的建立

2.1.1 檢測原理 采用電化學循環伏安法檢測葡萄糖氧化酶的反應原理[15-16]見式(3)～(6)，在一定的電壓下，二茂鐵甲醇(Fc) 發生氧化反應失去一個電子形成Fc+，在有氧化態葡萄糖氧化酶(GODox)和葡萄糖存在時，GODox氧化葡萄糖產生還原態葡萄糖氧化酶(GODred)和葡萄糖酸，生成的GODred還原Fc+產生GODox和Fc，重新生成的Fc補充擴散到電極表面發生氧化，從而增加電子傳遞的速度，峰電流增加。

工作電極表面：

FcCH2OH-e-=FcCH2OH+。

自然教育理念提倡讓幼兒在大自然中自然成長，幼兒美術是最接近自然的教學內容，對提升幼兒成長品質具有重要的促進作用。美術教學中，教師堅持自然教育，讓幼兒在自然氛圍、自然材料、自然互動中，充分的感受美、表現美。幼兒對美術活動始終保持濃厚的興趣，才能全身心投入到美術創作中，才能獲得更多的歡樂和笑聲，才能極大實現課堂教學目標。

(3)

葡萄糖氧化酶：

GOxox+glucose→[GOxox+glucose]，

(4)

[GOxox+glucose]→GOxred+gluconic acid，

(5)

GOxred+ FcCH2OH+→ GOxox+FcCH2OH。

(6)

2.1.2 標準曲線的繪制 不同濃度GOD的循環伏安曲線見圖1。由圖1可知，隨著GOD濃度的上升，陽極峰電流值在增高。峰電流值與酶濃度呈正比，介質濃度增加，電流值上升[17]。以峰電流值對酶濃度作圖(見圖2)，得到線性回歸方程：y=0.435x+1.414，相關系數為0.998。

2.1.3 精密度試驗 連續10次對100 μL 10 U/mL的葡萄糖氧化酶樣品進行測定，結果見表1。由表1可知，精密度試驗相對標準偏差(RSD)為0.031%，表明該檢測葡萄糖氧化酶活力的方法有較好的精確性。

2.1.4 回收率試驗 準備50 μL 1.282 U/mL的葡萄糖氧化酶溶液，再分別加入50 μL不同活力單位的葡萄糖氧化酶溶液，作回收率試驗，對每份樣品重復測量3次，結果取平均值。由表2可知，回收率在97.208%～104.538%，標準偏差在3.383%，表明此方法檢測葡萄糖氧化酶活力具有良好的準確性。

圖1 不同葡萄糖氧化酶酶濃度下的循環伏安掃描曲線Figure 1 The CV curves with different GOD enzyme concentration

圖2 峰電流與葡萄糖氧化酶活性的關系Figure 2 The relationship between the peak current and the GOD enzyme activity

2.2 電化學方法檢測黑曲霉孢子萌發中GOD的活性

2.2.1 黑曲霉孢子的萌發觀察 定時取接種于96孔板上中的孢子培養液10 μL涂布于載玻片[18]，采用顯微鏡觀察不同時間的孢子萌發情況(以萌發率表示)，結果見表3。由表3可知，在0～4 h時未見孢子萌發，但孢子體積略有增大；6 h

表1 精密度試驗Table 1 Test for precision

表2 回收率試驗結果Table 2 Test for recovery

2.2.2 黑曲霉孢子萌發過程中的酶活變化 定時掃描黑曲霉孢子培養液的循環伏安曲線，將得到的響應峰電流值代入到線性回歸方程中，計算得出其葡萄糖氧化酶濃度。將所得到的酶濃度對時間作圖，結果見圖3。在孢子萌發早期，即可以檢測到葡萄糖氧化酶的存在，Rosenberg等[19]提出了黑曲霉氧化葡萄糖生成葡萄糖酸的能力并不依賴于完整發育的細胞。Moksia等[8]的研究證明在黑曲霉孢子持有一個活躍的酶系統來氧化葡萄糖，正如工業發酵中常用的黑曲霉菌絲一樣。隨著孢子對營養條件產生反應，孢子吸水膨脹并萌發，合成新壁物質，相較于剛強的孢子膜結構通透性增強，便于自身與外界交換營養物質，酶體系活躍地氧化葡萄糖合成ATP為生長供給能量，培養8～10 h時GOD酶活力達到高峰。隨后，酶活力下降，可能是隨著菌絲生長，真菌為了更加復雜的生命活動發展其他的功能[20]。

表3 孢子隨時間的萌發率Table 3 Spores germination rate over time

2.3 對比試驗

在采用電化學循環伏安法測定孢子萌發過程中酶活性的同時，采用傳統的滴定法進行了佐證測定，結果見表4。整體而言，使用滴定法測出的結果都略低于電化學方法，可能是滴定法是通過肉眼判斷滴定終點的顏色變化。初始孢子的酶活力為 (1.355 ± 0.057) U/mL，隨著孢子開始萌發酶活力增強，趨勢與使用電化學方法測量結果一致，對比兩種測量GOD酶活力的方法，循環伏安法測定時間更短，操作更簡便，可將該法用于葡萄糖氧化酶的監測。

表4 滴定法測定葡萄糖氧化酶酶活的結果Table 4 The results of titration methods for determination of the activity of GOD U/mL

3 結論

本試驗通過研究二茂鐵甲醇、葡萄糖和葡萄糖氧化酶三者之間的循環伏安特性，建立了電化學測定GOD活性的方法，并使用方該法測定了黑曲霉孢子萌發過程中的GOD活性。研究結果表明：隨著酶濃度的上升，峰電流值呈現逐漸升高的趨勢，且在酶濃度為0.128～2.377 U/mL的范圍內線性良好(R2=0.998)。通過顯微鏡對黑曲霉孢子萌發過程的觀測發現，在30 ℃條件下培養10 h后，孢子的萌發率可達到86.534%，此時的葡萄糖氧化酶活力最強。本研究建立的電化學測定GOD活性的方法，能夠實現準確、快速和客觀地檢測標準酶以及葡萄糖酶酶活力。將其應用到黑曲霉孢子的酶活性檢測，為開發黑曲霉孢子作為GOD生物催化劑提供了新思路。

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Detection of GOD activity during the germination ofAspergillusnigerspores by electrochemical method

LIUYang-ru1

LIZhong-hai1,2

RENJia-li1, 2

(1.CollegeofFoodScienceandEngineering,CentralSouthUniversityofForestryandTechnology,Changsha,Hunan410004,China; 2.NationalEngineeringLaboratoryforRiceandBy-productDeepProcessing,Changsha,Hunan410004,China)

In this study, the electrochemical cyclic voltammetry method was developed for the determination of activity of glucose oxidase. The ferrocene methanol was introducing as the redox probes on cyclic voltammetry, using glassy carbon electrode as working electrode, saturated calomel electrode as reference electrode, platinum wire electrode as the counter electrode and the peak current value of different enzyme activity was required . There was a linear relationship between the peak current in enzyme concentration of 1.282～2.377 U/mL with the correlation coefficient as 0.998, the detection limit as 1.282 U/mL. The enzyme activity of spores from dormancy to germination was detected by this new method, as the enzyme activity of spores decreased after increasing first, reaching the maximum (2.130 U/mL). The traditional methods were tested at the same time. Compared with the traditional method, the proposed electrochemical method has the characteristics of accurate, fast and convenient.

Aspergillusnigerspores; germination; glucose oxidase; cyclic voltammetry

國家自然科學基金(編號：31340059)；湖南省自然科學基金(編號：2017JJ3523)；糧油深加工與品質控制湖南省2011協同創新項目(編號：湘教通[2013]448號)

劉洋汝，女，中南林業科技大學在讀碩士研究生。

任佳麗(1977—)，女，中南林業科技大學教授，博士。 E-mail:rjl_cl@163.com

2017—03—20

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.05.017