Osborne分級法提取藜麥糠清蛋白及功能性質研究

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(1.山西大學生命科學學院,山西太原 030006; 2.山西林業職業技術學院,山西太原 030009)

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Osborne分級法提取藜麥糠清蛋白及功能性質研究

田旭靜1,段鵬慧2,陳文超1,張婧婷1,范三紅1,*

(1.山西大學生命科學學院,山西太原 030006; 2.山西林業職業技術學院,山西太原 030009)

以藜麥糠為研究對象,采取超聲輔助Osborne分級法對藜麥糠中清蛋白進行提取。在單因素實驗基礎上,應用Box-Behnken方法選取料液比、提取溫度、提取時間3個因素,以清蛋白提取率為響應值進行優化,確定藜麥糠清蛋白的最優提取條件為:料液比1∶37 (g/mL)、提取溫度46 ℃、提取時間25 min，在此條件下藜麥糠清蛋白提取率為43.21%，與理論預測值43.76%相比,其相對誤差約為1.25%。說明通過響應面分析優化后得到的回歸方程在實踐指導方面具有一定的意義。對藜麥糠清蛋白功能(溶解性、持水力、乳化性、起泡性)特性進行了測定,結果表明pH為2.5即等電點時,清蛋白的溶解度最低,持水力最小達到1.33 g/g,乳化性最低,乳化穩定性反而最好,而起泡性和起泡穩定性在等電點附近均最差。

藜麥糠,清蛋白,Osborne 分級法,響應面分析法,功能特性

藜麥(Chenopodiumquinoa)是一種藜科假谷物,原產地在南美洲安第斯山脈地區,栽植歷史已有5000～7000年。古代印加人稱之為“mother of all grains”[1-2]。藜麥具有抗寒、抗旱、耐貧瘠和高鹽堿土壤等特征[3-4]。藜麥有增強機體功能、均衡營養、抗癌和減肥等功效,適于一系列慢性病的輔助治療[5]。因此被推薦為最適宜人類的完美“全營養食品”[6]。自1987年以來,我國在西藏地區試種藜麥[7],目前在山西、湖南和吉林等實現規模化種植[5]。藜麥優質蛋白含量高[8],容易被人體吸收[9]。Lamacchia[10]等的研究認為,藜麥中可利用的蛋白質含量比其他普通谷物要高。藜麥主要貯藏蛋白是清蛋白和球蛋白,谷蛋白和醇溶蛋白含量較低。由于二硫鍵的作用藜麥清蛋白具有較好的穩定性[11]。

目前國內對于藜麥產品的開發仍然處在初級階段,藜麥糠作為副產品經常被視為工業生產的廢料被遺棄,沒有得到綜合利用導致嚴重的資源浪費,因此對藜麥糠的開發仍有很大的研究空間。本研究以藜麥糠為原料,通過響應面分析對超聲輔助Osborne分級法提取藜麥糠清蛋白的最佳工藝條件進行優化,并對蛋白功能特性進行了研究,為進一步開發藜麥糠提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

藜麥糠 山西華青藜麥產品開發有限公司提供;大豆色拉油 由市場購得;所用其他試劑 均為分析純。

AL204電子分析天平 梅特勒-托利儀器上海有限公司;101-2AB型電熱鼓風干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司;SP-200OUV型紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司;TDL-5離心機 上海安亭科學儀器制造;868型pH測試儀 美國奧立龍公司;其他儀器 均為常規。

1.2實驗方法

1.2.1 藜麥糠預處理 篩選藜麥糠,粉碎過0.35 mm篩,置35 ℃鼓風干燥箱烘4 h,使其水分含量在5%以下,冷卻后密封干燥備用。

1.2.2 蛋白質含量測定 采用考馬斯亮藍法[12]測定蛋白質含量。以牛血清白蛋白濃度為橫坐標,吸光值為縱坐標,得到標準曲線方程Y=0.0073X+0.0109(R2=0.9981)。依據所測吸光度值可計算蛋白的含量。此方程具有良好的線性相關性[12]。

1.2.3 原料成分含量測定 水分含量測定:105 ℃烘箱恒重法(GB/T 20264-2006);脂肪含量測定:索氏抽提法(GB/T 5009.6-2003);蛋白質含量測定:微量凱氏定氮法(GB 5009.5-2010),考馬斯亮藍比色法;灰分含量測定:600 ℃灰化法(GB 5009.4-2010)。

1.2.4 藜麥糠分級蛋白提取工藝 藜麥糠中加入一定比例的蒸餾水,攪拌均勻,在40 ℃超聲輔助提取15 min,4000 r/min 離心20 min得到上清液A和殘渣A;上清液A經過沉淀、洗滌、干燥等處理步驟得到清蛋白。殘渣A繼續做下一步處理[13]。

表2 藜麥糠基本成分分析Table 2 Quinoa chaff basic composition analysis

向上一步操作所得的殘渣A中加入同比例2% NaCl溶液,提取過程同清蛋白,離心后得到上清液B和殘渣B;上清液B經過同上處理得到球蛋白。

向上一步操作所得殘渣B中加入同比例70%乙醇溶液,提取過程同清蛋白,離心后得到上清液C和殘渣C;上清液C經過同上處理得到醇溶蛋白。

向上一步操作所得殘渣C中加入同比例0.05 mol/L NaOH溶液,提取過程同清蛋白,離心后得到上清液D和殘渣D。上清液D經過同上處理得到谷蛋白。

測定上清液中各蛋白含量,分別求得藜麥糠中各蛋白質質量分數。

1.2.5 清蛋白等電點的測定 取藜麥糠清蛋白提取液7份,用磷酸鹽緩沖溶液調節pH分別為1.9、2.2、2.5、2.8、3.1、3.4、3.7,靜置后,蛋白質發生沉淀,離心后取上清液測定吸光度值,吸光度值最小的點對應的為蛋白質的等電點[14]。

1.2.6 單因素實驗 采用控制變量法[15]對藜麥糠中提取清蛋白的工藝進行單因素實驗設計。稱取藜麥糠粉2.0 g,以蒸餾水為提取溶劑,分別考查提取時間、料液比、提取溫度對清蛋白提取率的影響。固定料液比為1∶35,提取時間為25 min,在提取溫度為20、30、40、50、60 ℃條件下測定清蛋白提取率。固定料液比為1∶35,提取溫度40 ℃,在提取時間為15、20、25、30、35 min條件下測定清蛋白提取率。固定提取時間25 min,提取溫度40 ℃,在料液比1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45 (g/mL)條件下測定清蛋白提取率。

1.2.7 響應面實驗 根據單因素實驗結果,設計Box-Behnken中心組合實驗[16],其因素水平列于表1。

表1 Box-Behnken實驗設計因素水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.2.8 提取率計算 用考馬斯亮藍法[17]測定上清液中蛋白質的濃度。

蛋白質提取率(%)

1.2.9 藜麥糠清蛋白功能特性測定 對實驗室自制的藜麥糠清蛋白進行溶解性的測定[18],乳化性和起泡性[19]的測定,以及持水力的測定[18]。

1.3 數據處理

以Origin 7.0軟件繪制單因素實驗圖表,采用Design Expert 8.0.6軟件進行Box-Behnken設計及分析。

2 結果與分析

2.1原料成分分析

根據表2顯示的測定結果,該藜麥糠中蛋白質含量最多,其次是水分和脂肪,灰分含量相對較少。此測定結果為研究藜麥糠蛋白的理化性質打下了良好的基礎。

2.2藜麥糠中4種蛋白的含量

采用考馬斯亮藍法測定藜麥糠中4種蛋白質組分質量分數如圖1所示。

Osborne分級提取法將藜麥糠蛋白分為清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白。結果如圖1顯示,藜麥糠中清蛋白占蛋白總量的40.86%,4種蛋白中含量最多。藜麥糠球蛋白次之,占28.15%,藜麥糠谷蛋白和醇溶蛋白含量較少,分別占6.23%和4.45%。

圖1 藜麥糠4種蛋白的百分含量Fig.1 The percentage of quinoa chaff 4 kinds of protein

2.3清蛋白等電點的測定

由圖2可知,當pH在2.5左右時,藜麥糠清蛋白提取的上清液吸光度最小,蛋白沉淀最多,所以確定了藜麥糠清蛋白的等電點為pH=2.5。

圖2 吸光度值隨pH的變化曲線Fig.2 The absorbance value along with the change of pH curve

2.4單因素實驗

2.4.1 提取溫度對清蛋白提取率的影響 如圖3結果表明,清蛋白提取率隨提取溫度的增加呈現先上升后下降的趨勢,溫度在40 ℃達到最大值,可能是因為開始隨著提取溫度的升高,使分子擴散速率增加,有利于蛋白質溶出,提取率上升。溫度繼續升高提取率開始有所下降,原因可能是清蛋白是熱敏性較強的蛋白質,溫度繼續上升,部分蛋白質的結構可能被破壞而無法溶出,使得溶出量下降,導致提取率降低[20]。因此根據實驗結果,確定最佳提取溫度為40 ℃。

圖3 提取溫度對清蛋白提取率的影響Fig.3 The influence of temperature on albumin extraction yield

2.4.2 超聲提取時間對清蛋白提取率的影響 通過圖4可知,藜麥糠清蛋白提取率隨提取時間增加先增大后減小,且當提取時間是25 min時達到最大值34.09%。這可能是因為提取時間較短時,超聲波的作用強度不夠,而清蛋白的溶出需要一定的時間,清蛋白隨時間的增加能被充分提取,但當時間過長,清蛋白可能會被超聲波產生的巨大機械能所破壞[21],而發生蛋白質部分分解和變性,從而使得提取率降低,因此確定最適提取時間是25 min。

圖4 提取時間對清蛋白提取率的影響Fig.4 The influence of time on the albumin extraction yield

圖5 料液比對清蛋白提取率的影響Fig.5 The influence of solid-liquid ratio on the albumin extraction yield

2.4.3 料液比對清蛋白提取率的影響 通過圖5可知,藜麥糠清蛋白提取率隨料液比的減小先增大后減小。這可能是由于溶劑和樣品比例越大,濃度差則越大,增加了藜麥糠分子與溶液的接觸面積,進而加快了傳質的過程,但當料液比在1∶35～1∶45 g/mL之間時,清蛋白提取率不增加甚至降低[22],這是因為加水量繼續增加,蛋白的溶解已經達到飽和,加水過多導致酸沉時上清液中清蛋白的溶解量增加,造成蛋白損失量的增高,提取率反而下降[23]。因此確定料液比1∶35 g/mL為宜。

表3 響應面實驗設計及結果Table 3 The response surface design of experimental results

表4 回歸方程方差分析Table 4 The variance analysis of regression equation

注:*差異顯著,p<0.05;**差異極顯著,p<0.01。2.5響應面實驗

在單因素實驗的基礎上,設計響應面實驗,響應面實驗方案及結果見表3。

2.5.1 回歸方程的建立與方差分析 利用Design Expert 8.0.6軟件對表3數據進行多元回歸擬合,建立提取工藝參數回歸模型。回歸方程為:Y=42.43+3.93A-0.21B+0.64C+0.27AB+0.79AC+1.06BC-3.50A2-2.67B2-1.39C2。該方程中各項系數絕對值的大小可以反映各因素對響應值的影響程度,系數的正、負反映了影響的方向[24]。由方程的一次項系數可以得出影響藜麥糠清蛋白提取率的因素的主次順序為A提取溫度>C料液比>B提取時間。對該模型進行方差分析,結果見表4。

2.5.2 響應面分析 根據表4結果,利用Design Expert 8.0.6繪制響應面三維圖形,固定其中一個因素在0水平不變,考慮其他2個因素的交互作用對藜麥糠清蛋白提取率的影響,分析AB、AC、BC這3組交互作用對清蛋白提取率的影響[26]。其響應面圖如圖6。由3組圖可知,提取溫度(A)曲線最陡,說明該因素對清蛋白提取率影響最大;料液比(C)和提取時間(B)曲線相對較平緩,響應值變化隨其數值的變化不大,說明這兩個因素對清蛋白提取率的影響程度相對于提取溫度(A)較弱,這與方差分析的結果一致。等高線的形狀也可以反映交互效應的強弱,越接近橢圓形交互作用越顯著,越接近圓形交互作用不顯著。分析可知,提取時間(B)和料液比(C)交互作用最顯著,其后是提取溫度(A)和料液比(C)交互作用較顯著,而提取溫度(A)和提取時間(B)的交互作用最不顯著。

圖6 各因素交互作用對清蛋白提取率的等高線和響應面圖Fig.6 The contour and response surface figure of various factors interaction albumin extraction yield

圖6(a)響應面圖顯示,提取溫度30～45 ℃,提取時間20～26 min范圍內時,藜麥糠清蛋白提取率隨著溫度和時間的增加而升高;而當提取溫度在45～50 ℃范圍內,提取時間26～30 min,藜麥糠清蛋白提取率隨著兩者的增加開始降低。由圖6(a)還可知,在提取溫度的42～46 ℃水平和提取時間的24～26 min水平之間有最大值。圖6(b)顯示,提取溫度30～45 ℃,料液比1∶30～1∶35范圍內時,兩者存在較顯著的增效作用,藜麥糠清蛋白提取率隨著溫度和料液比水平的增加而升高;而當提取溫度在45～50 ℃,料液比1∶35～1∶40范圍內時,藜麥糠清蛋白提取率反而開始降低。圖6(c)可知,提取時間20～26 min,料液比1∶30～1∶35范圍內時,兩者的增效作用最顯著,藜麥糠清蛋白提取率隨著時間和料液比水平的增加而升高,而當在提取時間26～30 min,料液比1∶35～1∶40范圍內時,藜麥糠清蛋白提取率隨著兩因素的增加開始降低,并且在提取時間的25～27 min和料液比的1∶35～1∶40之間有最大值。

由Design Expert 8.0.6軟件得出的清蛋白的最佳提取條件為:提取溫度46.13 ℃、提取時間25.39 min、料液比1∶37。此條件下模型預測的最大提取率為43.7636%。考慮到實際操作的局限性,將理論值修正為提取溫度46 ℃、提取時間25 min、料液比1∶37。此條件下做驗證實驗,所得的清蛋白提取率為43.21%,與理論值43.7636%接近,說明該模型能較好地預測實際提取量。

2.6藜麥糠清蛋白功能特性測定

2.6.1 溶解性的測定 由圖7可以看出,藜麥糠清蛋白的溶解度呈現先下降后上升的趨勢。當pH為2.5時,清蛋白的溶解度最低,是因為在等電點處,蛋白質表面所帶的總電荷為零,蛋白質分子之間的靜電排斥力較小,由于疏水相互作用使導致蛋白質分子之間聚集沉淀。pH離清蛋白的等電點越遠,其水化作用越弱,水分子對清蛋白的分散作用提升明顯,表現為清蛋白的溶解度增加。

圖7 pH對清蛋白溶解度的影響Fig.7 The influence of pH value on albumin solubility

2.6.2 持水力的測定 圖8可知,藜麥糠清蛋白的持水力隨pH的變化大致呈V型曲線,當pH逐漸靠近等電點時,清蛋白的持水力逐漸降低,當pH偏離等電點時,清蛋白的持水力顯著提升。很明顯可以發現,pH對清蛋白持水能力的影響與pH對其溶解度的影響基本一致。當pH在等電點(pH2.5)附近時,清蛋白質分子本身呈現電中性,蛋白質分子之間的相互作用達到最強,相互締合收縮,蛋白質呈現最低的水合作用,所以持水力最小達到1.33 g/g。高于或低于等電點,由于凈電荷和排斥力的增加使蛋白質持水力增強。

圖8 pH對清蛋白持水力的影響Fig.8 The influence of pH value on albumin hold water

2.6.3 乳化性的測定 如圖9所示,藜麥糠清蛋白的乳化性在等電點附近最低,乳化穩定性反而最好。當pH偏離等電點時,清蛋白的溶解度增大,從而乳化性增大,pH對藜麥糠清蛋白乳化性的影響與pH對其溶解度的影響基本一致,這表明蛋白質乳化性與溶解度有密切關系。

圖9 pH對清蛋白乳化性的影響Fig.9 The influence of pH value on albumin emulsification

2.6.4 起泡性的測定 由圖10可知,pH對藜麥糠清蛋白起泡性的影響與pH對其溶解度的影響趨勢都呈“V”字型,在等電點處蛋白質聚集沉淀從而導致起泡性降低。所以清蛋白的起泡性和起泡穩定性在等電點附近均最差,且泡沫大小不均勻,消失很快。而在遠離等電點時,清蛋白溶解度和表面活性增加,從而使清蛋白的起泡性和起泡穩定性均得到改善[18]。

圖10 pH對清蛋白起泡性的影響Fig.10 The influence of pH value on albumin foaming

3 結論

通過超聲輔助Osborne分級法對藜麥糠進行蛋白提取,得到的4種蛋白,其中清蛋白含量最多,占蛋白總量的40.86%。藜麥糠球蛋白次之,占28.15%,藜麥糠谷蛋白和醇溶蛋白含量較少,分別占6.23%和4.45%。進而對藜麥糠中清蛋白采用超聲輔助水提的方法進行優化,在單因素實驗的基礎上,將Box-Behnken實驗設計原理和響應面分析法相結合,擬合了料液比、提取溫度、提取時間這3個因素對清蛋白提取率的回歸模型,經檢驗證明該模型合理可靠,最優工藝條件為提取溫度46 ℃、提取時間25 min、料液比1∶37。在此條件下,得到藜麥糠清蛋白提取率為43.21%。通過模型系數顯著性檢驗,得到因素的主效應關系為:提取溫度>料液比>提取時間。通過對藜麥糠清蛋白功能(溶解性、持水力、乳化性、起泡性)特性的測定發現,在等電點附近時,清蛋白的溶解度最低,持水力最小達到1.33 g/g,乳化性最低,乳化穩定性反而最好,而起泡性和起泡穩定性在等電點附近均最差。偏離等電點,清蛋白功能性質得到改善。它可以作為一種頗具開發前景的功能性食品配料應用于食品工業中。

[1]Koziol M J.Chemical composition and nutritional evalua-tion of quinoa(ChenopodiumquinoaWilld.)[J].Journal of Food Composition and Analysis,1992,5(1):35-37.

[2]Repo Carrasco R,Espinoza C,Jacobsen S E.Nutritional value and use of the andean crops quinoa(Chenopodiumquinoa)and kaniwa(Chenopodiumpallidicaule)[J].Food Reviews International,2003,19(1):179-180.

[3]Jacobsen S E,Mujica A,Jensen C R. The resistance of quinoa(ChenopodiumquinoaWilld.)to adverse abiotic factors[J]. Food Reviews International,2003,19(1/2):99-109.

[4]Escuredo O,Martín M I G,Moncada G W,et al. Amino acid profile of the quinoa(ChenopodiumquinoaWilld.)using near infrared spectroscopy and chemometric techniques[J]. Journal of Cereal Science,2014,60(3):67-74.

[5]肖正春,張廣倫.藜麥及其資源開發利用[J].中國野生植物資源,2014,33(2):62-66.

[6]丁云雙,曾亞文,閔康,等.藜麥功能成分綜合研究與利用[J]. 生物技術進展,2015,5(5):341-342.

[7]貢布扎西,旺姆,張崇璽,等.南美藜在西藏的生物學特性表現[J].西南農業學報,1994,7(3):54-62.

[8]Abugoch L,Romero N,Tapia C,et al.Study of some physicochemical and functional properties of quinoa(ChenopodiumquinoaWilld.)protein isolates[J].Agriculture Food Chemistry,2008,56(2):4745-4750.

[9]王黎明,馬寧,李頌,等.藜麥的營養價值及其應用前景[J].食品工業科技,2014,35(1):381-384.

[10]Lamacchia S,Chillo S,Lamparelli N,et al. Amaranth,quinoa and oat doughs-mechanical and rheological behaviour,polymeric protein size distribution and extractability[J].J Food Eng,2010,96(1):97-106.

[11]Brinegar C,Sine B,Nwokocha L. Highcysteine 2S seed storage proteins from quinoa(Chenopodiumquinoa)[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,1996,44(7):1621-1623.

[12]柳蔭,吳鳳智,陳龍,等. 考馬斯亮藍法測定核桃水溶性蛋白含量的研究[J].中國釀造,2013,32(12):131-132.

[13]全越,王長遠. Osborne分級法提取燕麥麩球蛋白的響應面分析[J]. 糧食加工,2015,40(5):34-35.

[14]訾艷,王常青,陳曉萌,等. 白蕓豆清蛋白提取工藝及分子組成研究[J]. 食品工業科技,2014,35(15):121-122.

[15]郜海燕,李興飛,陳杭君,等. 山核桃多酚物質提取及抗氧化研究進展[J]. 食品科學,2011,32(5):336-341.

[16]張瑤,李嘯,潘冬瑞,等. Box-Benhnken設計優化植物乳桿菌培養基[J]. 天津農業科學,2013,19(7):1-5.

[17]趙英永,戴云,崔秀明,等. 考馬斯亮藍 G-250染色法測定草烏中可溶性蛋白質含量[J]. 云南民族大學學報:自然科學版,2006,15(3):235-237.

[18]鄧芝串,張超,張暉,等.黑籽瓜種子蛋白質的功能特性[J].食品工業科技,2014,35(10):115-119.

[19]張維農,劉大川,胡小泓. 花生蛋白產品功能特性的研究[J]. 中國油脂,2002,27(5):60-65.

[20]陳建旭,黃生權.赤靈芝中水溶性蛋白響應面法優化提取[J].現代食品科技,2009,25(6):661-663.

[21]褚福紅,陸寧,于新,等. 響應面法優化微波提取野菊花抗氧化物質[J].食品科學,2010,31(24):90-94.

[22]Eskilsson C S,Bjorklund E. Analytical-scale microwaveassisted extraction[J].Journal of Chromatography A,2000,902(1):227-250.

[23]鐘俊楨,頓儒艷,黃宗蘭,等. 腰果蛋白的提取工藝條件優化[J]. 食品科學,2014,35(16):20-21.

[24]肖衛華,韓魯佳,楊增玲,等. 響應面法優化黃芪黃酮提取工藝的研究[J]. 中國農業大學學報,2007,12(5):52-56.

[25]陳紅梅,謝翎.響應面法優化半枝蓮黃酮提取工藝及體外抗氧化性分析[J]. 食品科學,2016,37(2):48-49.

[26]陳仕學,郁建平,楊俊,等.響應面法優化陽荷水溶性膳食纖維的微波提取工藝研究[J]. 食品科學,2014,35(18):57-62.

ExtractofalbuminfromquinoachaffbyOsborneclassificationmethodandfunctionalproperties

TIANXu-jing1,DUANPeng-hui2,CHENWen-chao1,ZHANGJing-ting1,FANSan-hong1,*

(1.College of Life Science,Shanxi University,Taiyuan 030006,China; 2.Shanxi Forestry Vocational and Technical College,Taiyuan 030009,China)

Quinoa chaff is the research object,albumin from quinoa chaff was extracted by using ultrasonic auxiliary Osborne classification method. Three extraction parameters including solid-liquid ratio,extraction temperature and extraction time were optimized using Box-Behnken method and response surface methodology with protein extraction ratio as the response value. The research was based on single factor experiments for achieving maximum the protein extraction ratio. The optimal extraction conditions were determined as a solid/liquid ratio of 1∶37 (g/mL),an extraction temperature of 46 ℃,and an extraction time of 25 min. Under these optimized conditions,quinoa chaff albumin extraction yield was 43.21%,compared to the theoretical value 43.76%,the relative error of 1.25%. Optimized by response surface regression equation derived some practical significance. Experiment of quinoa chaff albumin functional properties(solubility and hold water,emulsification,foaming)were determined. The results showed that pH2.5 isoelectric point,namely the solubility of albumin was the lowest,a hold water minimum was 1.33 g/g,emulsification was lowest,but emulsifying stability was best,and the foaming ability and foam stability in isoelectric point nearby were worst.

quinoa chaff;albumin;Osborne classification method;response surface analysis;functional properties

2016-11-28

田旭靜(1992-)，女，碩士研究生，研究方向：農產品綜合利用開發，E-mail：497792954@qq.com。

*通訊作者:范三紅(1963-)，男，大學本科，教授，研究方向:食品科學，E-mail：fsh729@sxu.edu.cn。

山西省自然科學基金項目(2012011031-4)；2016年山西省高等學校教學改革創新項目 (J2016003)；2016年山西省研究生教育改革研究課題(2016JG26)；山西省重點研發計劃(一般項目)(201603D221004-4)。

TS201.1

:B

:1002-0306(2017)12-0264-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.12.048