高壓滅菌前后黨參口服液中多糖的免疫活性研究

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(1.華南農業大學食品學院,廣東廣州 510642;2.廣東省天然活性物工程技術研究中心,廣東廣州 510642;3.華南農業大學測試中心,廣東廣州 510642;4.無限極(中國)有限公司,廣東江門 529156)

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高壓滅菌前后黨參口服液中多糖的免疫活性研究

余雪婷1,2,曹庸1,2,劉耀慧1,2,賀麗蘋2,3,*,李文治4,陳洪璋4

(1.華南農業大學食品學院,廣東廣州 510642;2.廣東省天然活性物工程技術研究中心,廣東廣州 510642;3.華南農業大學測試中心,廣東廣州 510642;4.無限極(中國)有限公司,廣東江門 529156)

研究高壓滅菌前后黨參口服液中多糖的免疫活性變化。采用醇沉法、超濾膜分離法得到黨參口服液中活性多糖部分,以RAW264.7巨噬細胞為模型,通過對細胞增殖指數、吞噬指數、NO釋放量以及細胞因子(IL-6、IL-1β、TNF-α)的分泌量的測定,評價高壓滅菌前后黨參口服液中多糖的免疫活性。結果表明:超濾分離得到高壓滅菌前以及高壓滅菌后黨參口服液中分子量小于30 kDa的多糖組分CPP-2和HCPP-2，其得率分別為22.41%和15.91%，純度分別為69.03%和69.30%，且二者均能較好地促進巨噬細胞增殖(增殖指數=1.13～1.48)，因此CPP-2和HCPP-2是黨參口服液中主要的活性多糖部分。與CPP-2相比，HCPP-2在25～400 μg/mL濃度范圍內作用于巨噬細胞的吞噬能力、TNF-α和IL-1β生成顯著性降低(p<0.05)；在100～400 μg/mL 濃度范圍內，NO和IL-6生成顯著性降低(p<0.05)。說明高壓滅菌會導致黨參口服液中多糖的免疫活性降低。

黨參口服液,高壓滅菌,多糖,巨噬細胞RAW264.7,免疫活性

黨參為桔梗科植物黨參(Codonopisispilosula(Franeh.)Nannf)、素花黨參(CodonopsispilosulaNannf.var.modesta(Nann)L.T.shen)或川黨參(Codonopisistangshenoliv)的干燥根，具有補中益氣、健脾益肺的功效,主治脾肺虛弱、食少便塘、虛喘咳嗽、內熱消渴等癥[1]。多糖作為一類碳水化合物,是由單糖聚合成聚合度大于10的極性大分子,具有多種生物活性。近年來,由于植物多糖的低毒性以及廣泛的治療屬性,比如抗腫瘤[2]、免疫調節[3]、抗氧化、抗炎[4]等活性,引起人們的廣泛關注。黨參多糖是黨參中的主要有效成分之一,含量較高,經過優化提取工藝后,水溶性黨參多糖的得率可達26.45%～34.5%[5-6]。免疫系統是機體一個極其復雜而又重要的生物體系,一旦失去平衡,將會影響機體免疫應答從而引起各種疾病。植物多糖因其顯著的療效和低毒性,已經作為一種公認的免疫調節劑。近年來,國內外學者對黨參多糖的免疫活性進行了研究,驗證了黨參多糖具有較好的免疫增強作用[7-8]。

膜分離技術工藝簡便,得率更高,且不損害物質活性,近年來已廣泛應用于多糖、蛋白等大分子的分離純化。楊陽等[9]采用超濾法分離獲得灰樹花多糖的六個多糖組分均能顯著地促進小鼠脾淋巴細胞轉化增殖的作用。

目前黨參的應用有直接煎服、制成黨參口服液[10]、制成黨參多糖滴丸[11]等方式。為使黨參這一地道藥材得到更加充分的應用,采用沸水提取、高壓滅菌[12]的方式將黨參藥材制成口服液。為對比黨參口服液的制備工藝——高壓滅菌對黨參口服液中多糖免疫活性的影響,本研究將采用醇沉法、超濾膜分離法得到高壓滅菌處理前后黨參口服液中的活性多糖,并通過巨噬細胞RAW264.7評價高壓滅菌處理前后黨參口服液中的活性多糖的免疫活性變化,以期為開發黨參口服液提供理論基礎和科學指導。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

渭黨參 甘肅岷縣;無水乙醇、乙酸、苯酚、硫酸 天津市富宇精細化工有限公司;單糖對照品、脂多糖(LPS)、噻唑藍(MTT) Sigma-Aldrich公司;DEME高糖培養基、雙抗(青霉素-鏈霉素)、南美胎牛血清、谷氨酰胺、胰酶 美國Gibico公司;二甲基亞砜 美國Amresco公司;對氨基苯磺酸、N-1-萘乙二胺鹽酸鹽、中性紅 天津市科密歐化學試劑公司;小鼠單核巨噬細胞白血病細胞(RAW264.7) 中國科學院昆明細胞庫;細胞因子試劑盒 欣博盛生物科技有限公司。

30 kDa超濾管 廣州齊云生物科技公司;FD-1型真空冷凍干燥機 Thermo-Savant;CCL-1708-8二氧化碳培養箱 ESCO;EnSpire酶標儀 Perkin-Elmer;BDS200倒置生物顯微鏡 重慶奧特光學儀器公司;MH-2微量振蕩器 海門市其林貝爾儀器公司。

1.2實驗方法

1.2.1 黨參口服液的制備以及高壓滅菌處理 黨參口服液的制備參照張占軍等[13]和吳蘭芳等[14]的方法,并做適當修改。稱取黨參原料100 g,按照1∶12的料液比沸水提取1.5 h,提取2次。經80目篩網過濾至貯液鍋內,合并兩次提取濾液,在85 ℃的條件下減壓濃縮至固形物含量為25%。按照濃縮液∶蒸餾水=1∶3的比例配制成口服液,平均分成兩份,正常組不做處理,高壓滅菌組在121 ℃的條件下滅菌26 min。

1.2.2 高壓滅菌前后黨參口服液中粗多糖的提取 黨參口服液中粗多糖的提取參照劉軍海[15]和楊陽等[9]的方法,并做適當修改。取正常組和高壓滅菌組的口服液200 mL,測定固形物含量后加入800 mL無水乙醇,充分振蕩后靜置2 h,3000 r/min離心10 min后去除上清液,沉淀用80%乙醇清洗三遍,真空冷凍干燥后得正常組(CPP)和高壓滅菌組(HCPP)粗多糖。分別將正常組和高壓滅菌組的粗多糖溶解于蒸餾水中,0.45 μm的濾膜過濾除去不溶物,用分子截留量為30 kDa的超濾膜,將正常組粗多糖分為分子量>30 kDa(CPP-1)和分子量<30 kDa(CPP-2)兩部分,同理,將高壓滅菌組分為HCPP-1(分子量>30 kDa)和HCPP-2(分子量<30 kDa)兩部分。冷凍干燥,稱重,按下式計算得率:

式中:W1為各分子量段多糖的質量(g);W為口服液的干物質重量(g)。

1.2.3 多糖純度的測定 采用苯酚-硫酸法[16]測定CPP-1、CPP-2、HCPP-1、HCPP-2中的總糖含量。按下式計算多糖純度:

1.2.4 巨噬細胞增殖實驗 采用MTT法[17],測定樣品對體外培養巨噬細胞增殖的影響。將處于對數生長期的巨噬細胞調整密度為105 個/mL接種于96孔培養板中，每孔200 μL，于5% CO2濃度、37 ℃條件下培養12 h后棄去上清，分別加入空白組(只含培養基)、實驗組(25、50、100、200、400 μg/mL的CPP、HCPP、CPP-1、CPP-2、HCPP-1和HCPP-2)和陽性對照組(2 μg/mL的LPS)樣品各200 μL培養24 h。棄掉上清,每孔加入0.5 mg/mL的MTT 100 μL,培養4 h后加入150 μL 二甲基亞砜,振蕩10 min,使甲瓚徹底溶解,酶標儀波長570 nm處測定OD值,對細胞增殖能力按下式計算增殖指數，最終篩選出的高活性多糖部分。

1.2.5 巨噬細胞吞噬中性紅實驗 將處于對數生長期的巨噬細胞調整密度為105 個/mL接種于96孔培養板中，每孔200 μL，于5% CO2濃度、37 ℃條件下培養12 h后棄去上清，分別加入空白組(只含培養基)、實驗組(25、50、100、200、400 μg/mL的CPP-2和HCPP-2)和陽性對照組(2 μg/mL的LPS)樣品各200 μL培養24 h。棄掉上清,每孔加入0.1%的中性紅溶液100 μL,37 ℃、5% CO2的培養箱中繼續培養1 h,棄去中性紅,用PBS洗掉多余的中性紅。加入細胞裂解液(1%的乙酸(V/V)溶于50%的乙醇(V/V)中),將細胞平板平穩放置24 h以充分裂解細胞,酶標儀于540 nm處測定OD值。巨噬細胞對中性紅吞噬能力用吞噬指數表示,計算公式如下：

1.2.6 NO生成的測定 通過測定體外培養的巨噬細胞上清液中亞硝酸鹽含量來表征其NO生成[18]。將處于對數生長期的巨噬細胞調整密度為105 個/mL接種于96孔培養板中，每孔200 μL，于5% CO2濃度、37 ℃條件下培養12 h后棄去上清，分別加入空白組(只含培養基)、實驗組(25、50、100、200、400 μg/mL的CPP-2和HCPP-2)和陽性對照組(2 μg/mL的LPS)樣品各200 μL培養24 h。取各組上清液100 μL,加入Griess試劑100 μL,室溫下振蕩10 min,酶標儀于540 nm處測定OD值。以NaNO2為對照品,繪制標準曲線,得到回歸方程:y=1.8008x+0.0721,R2=0.9978。計算上清液中的亞硝酸鹽含量。

1.2.7 細胞因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)生成的測定 將處于對數生長期的巨噬細胞調整密度為105 個/mL接種于96孔培養板中，每孔200 μL，于5% CO2濃度、37 ℃條件下培養12 h后棄去上清，分別加入空白組(只含培養基)、實驗組(25、50、100、200、400 μg/mL的CPP-2和HCPP-2)和陽性對照組(2 μg/mL的LPS)樣品各200 μL培養24 h。取各組上清液100 μL,按照試劑盒標注方法,對TNF-α、IL-6和IL-1β進行測定,于450 nm下測定OD值,繪制標準曲線,得到TNF-α、IL-6和IL-1β的回歸方程:y=0.0007x+0.0632,R2=0.992;y=0.0026x+0.1618,R2=0.9905;y=0.0018x+0.0619,R2=0.995。計算上清液中細胞因子的含量。

1.2.8 統計學分析 采用Microsoft Excel 2010進行數據處理,Origin 8.5進行作圖,SPSS 19.0進行顯著性分析,數值以均值±標準差的形式表示。

表1 高壓滅菌前后黨參口服液中不同分子量段多糖的得率及純度Table 1 Yield and purity of different molecular weight polysaccharides from Codonopsis pilosulaoralsolution before and after autoclaving

注:*表示CPP-2與CPP-1對比,HCPP-2與HCPP-1相比具有顯著性差異,p<0.05。

2 結果與分析

2.1高壓滅菌前后黨參口服液中不同分子量段多糖的得率及純度

高壓滅菌前后黨參口服液中不同分子量段多糖的得率及純度結果見表1。由表1可知,高壓滅菌前后分子量大于30 kDa的多糖(CPP-1、HCPP-1)得率分別為4.06%和5.61%,分子量小于30 kDa的多糖(CPP-2、HCPP-2)得率分別為22.41%和15.91%,表明黨參口服液中分子量小于30 kDa的多糖含量較高。滅菌前后黨參口服液中分子量小于30 kDa的多糖純度分別為69.03%和69.30%,顯著高于分子量大于30 kDa的多糖(p<0.05)。

2.2高壓滅菌前后黨參口服液中的多糖對巨噬細胞增殖的影響

病原微生物進入機體的第一道防線是吞噬細胞,其中巨噬細胞是機體免疫系統中重要的吞噬細胞。研究表明,免疫細胞在受到LPS等外界刺激后能夠啟動機體內炎癥介質的產生,刺激免疫細胞的成熟、分化和增殖[18]。由圖1可知,在25～200 μg/mL濃度范圍內,CPP對巨噬細胞的增殖活性緩慢增加并達到最大值,在400 μg/mL濃度時有所降低。HCPP的活性先是處于穩定水平,在400 μg/mL時增大至與同等濃度下的CPP的活性接近;在25～400 μg/mL濃度范圍內,CPP-1和HCPP-1的增殖指數皆小于1,且隨著濃度的升高,增殖指數逐漸降低,說明該樣品的添加對巨噬細胞的增殖出現了顯著的抑制作用(p<0.05);在25～100 μg/mL濃度范圍內,CPP-2的活性逐漸增強并達到最大值,在100～400 μg/mL濃度范圍內,CPP-2的活性出現緩慢下降的趨勢,在25～200 μg/mL濃度范圍內,其活性顯著優于陽性對照組(p<0.05);在25～400 μg/mL濃度范圍內,HCPP-2的活性呈現緩慢上升的趨勢;綜上，由增殖結果可知，CPP-2與HCPP-2的增殘指數在1.13～1.48的范圍內，具有良好的刺激巨噬細胞增殖的活性,且得率和純度較高,是黨參多糖的高活性多糖部分;在25～200 μg/mL濃度范圍內,CPP-2的活性顯著優于HCPP-2(p<0.05)。因此,在下一步實驗中僅對比CPP-2與HCPP-2的活性來判斷高壓滅菌前后黨參口服液中多糖的免疫活性變化。

圖1 高壓滅菌前后黨參口服液中不同分子量段的多糖對巨噬細胞增殖的影響Fig.1 Effects of different molecular weight polysaccharide from Codonopsis pilosula oral solution before and after autoclaving on proliferation of macrophages

2.3高壓滅菌前后黨參口服液中的多糖對巨噬細胞吞噬作用的影響

吞噬作用是巨噬細胞的一種主要功能,在機體非特異性免疫中起重要作用。巨噬細胞可吞噬體內的各種病原微生物、腫瘤細胞以及體內的死細胞等,形成的吞噬體與溶酶體結合并在多種酶的作用下消化殺滅各種抗原性異物[17]。由圖2可知,在25～400 μg/mL濃度范圍內,CPP-2和HCPP-2組的吞噬作用呈現出逐漸上升的趨勢,當濃度大于100 μg/mL時,兩者的吞噬作用增加地較為緩慢,且整體低于陽性對照組。表明當濃度大于100 μg/mL時,CPP-2,HCPP-2都能有效地激活巨噬細胞,并改善其吞噬能力,從而提高機體免疫力。比較可知,CPP-2的吞噬活性顯著優于HCPP-2(p<0.05)。

圖2 高壓滅菌前后黨參口服液中的多糖對巨噬細胞吞噬作用的影響Fig.2 Effect of polysaccharide from Codonopsis pilosula oral solution before and after autoclaving on phagocytosis of macrophages

2.4高壓滅菌前后黨參口服液中的多糖對巨噬細胞NO生成的影響

NO是一種能調節細胞多種功能的第二信使分子,在體內廣泛參與多種生理和病理過程。研究表明,巨噬細胞的抗腫瘤、抗病毒、炎癥反應及免疫反應由NO的釋放來完成。由圖3可知,在25～50 μg/mL濃度范圍內,CPP-2和HCPP-2組的活性差異不大,且均低于空白組以及陽性對照組;在100～400 μg/mL濃度范圍內,隨著濃度的增加CPP-2組的活性呈現出逐漸增強的趨勢,而HCPP-2的活性未出現顯著性變化。這可能與CPP-2,HCPP-2能夠通過NF-κB信號通路調節巨噬細胞中iNOS的表達有關[19]。比較可知,在100～400 μg/mL 的濃度范圍內,CPP-2組的活性顯著優于HCPP-2(p<0.05)。

圖3 高壓滅菌前后黨參口服液中的多糖對巨噬細胞NO生成的影響Fig.3 Effect of polysaccharide from Codonopsis pilosula oral solution before and after autoclaving on NO production of macrophage

2.5高壓滅菌前后黨參口服液中的多糖對巨噬細胞TNF-α生成的影響

巨噬細胞被激活后,迅速表達各種細胞因子,介導宿主細胞的免疫反應,進而增強機體免疫能力。由圖4可知,在25～400 μg/mL濃度范圍內,CPP-2和HCPP-2組的活性都呈現出逐漸上升的趨勢,且CPP-2組的活性顯著高于HCPP-2組(p<0.05)。

圖4 高壓滅菌前后黨參口服液中的多糖對巨噬細胞TNF-α生成的影響Fig.4 Effect of polysaccharide from Codonopsis pilosula oral solution before and after autoclaving on TNF-α production of macrophage

2.6高壓滅菌前后黨參口服液中的多糖對巨噬細胞IL-6生成的影響

由圖5可知,在25～400 μg/mL濃度范圍內,CPP-2組的活性呈現出逐漸上升的趨勢,HCPP-2組的活性基本不變。當濃度大于100 μg/mL時,CPP-2組的活性顯著高于HCPP-2(p<0.05)。

圖5 高壓滅菌前后黨參口服液中的多糖對巨噬細胞IL-6生成的影響Fig.5 Effect of polysaccharide from Codonopsis pilosula oral solution before and after autoclaving on TNF-α production of macrophage

2.7高壓滅菌前后黨參口服液中的多糖對巨噬細胞IL-1β生成的影響

由圖6可知,在25～400 μg/mL濃度范圍內,CPP-2和HCPP-2組的活性都呈現出逐漸上升的趨勢,且CPP-2組的活性顯著優于HCPP-2(p<0.05)。

圖6 高壓滅菌前后黨參口服液中的多糖對巨噬細胞IL-1β生成的影響Fig.6 Effect of polysaccharide from Codonopsis pilosula oral solution before and after autoclaving on IL-1β production of macrophage

3 討論

超濾膜是利用不對稱的微孔結構對大分子以及小分子進行分離,并能有效保證所分離物質的生物活性[16]。因此本研究采用超濾法分離黨參口服液中的多糖分離成分子量>30 kDa以及分子量<30 kDa兩部分,分離效果較好,得率較高,有利于后續實驗的開展。

高壓滅菌常用來口服液灌裝后的滅菌,主要有利于殺滅微生物以及增加口服液在貯存運輸中的穩定性。本研究利用巨噬細胞模型,對高壓滅菌前后黨參口服液中活性多糖的免疫活性進行評價。結果表明,與滅菌前相比,高壓滅菌后黨參口服液中的活性多糖,在25～400 μg/mL濃度范圍內作用于巨噬細胞的吞噬能力、TNF-α和IL-1β生成顯著性降低;在100～400 μg/mL 濃度范圍內,NO和IL-6生成顯著性降低。多糖的生理活性主要與分子量、單糖組成、糖苷鍵等分子結構特征相關[20,21],高壓滅菌條件劇烈,可能會導致黨參多糖的部分糖苷鍵發生斷裂,使其分子量大小以及單糖組成發生變化,從而造成高壓滅菌后免疫活性的降低。

4 結論

采用醇沉法、超濾膜分離法得到黨參口服液的活性多糖部分,并利用巨噬細胞模型評價高壓滅菌前后黨參口服液中多糖的免疫活性變化。結果表明,高壓滅菌后的多糖組巨噬細胞的增殖指數、吞噬指數、NO釋放量以及細胞因子的分泌量均有不同程度的下降。本研究采用超濾技術分離具有免疫活性的黨參多糖組分,能夠有效保留其生物活性[16],因此相關免疫活性的實驗結果可為黨參口服液的開發提供理論基礎和科學指導。

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StudyofimmunocompetenceofpolysaccharidesfromCodonopsispilosulaoralsolutionbeforeandafterautoclaving

YUXue-ting1,2,CAOYong1,2,LIUYao-hui1,2,HELi-ping2,3,*,LIWen-zhi4,CHENHong-zhang4

(1.College of Food Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China; 2.Guangdong Engineering Research Center of Natural Active Substance,Guangzhou 510642,China; 3.Instrumental Analysis & Research Center,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China; 4.Infinitus(China)Co.,Ltd.,Jiangmen 529156,China)

To study the changes of immunocompetence of polysaccharides fromCodonopsispilosulaoral solution before and after autoclaving,the methods of alcohol precipitation and ultrafiltration membrane were used,the active polysaccharides ofCodonopsispilosulaoral solution before and after autoclaving were obtained,and their immune activities were evaluated by measuring inflammatory responses in RAW264.7 macrophages of cell proliferation index,phagocytic index,NO release and secretion of cytokines(IL-6,IL-1β,TNF-α).The results showed that the yields of polysaccharide fraction with molecular weight less than 30 kDa before autoclaving and autoclaving in Codonopsis pilosula oral solution(COP-2 and HCOP-2)were 22.41% and 15.91%, the purity were 69.03% and 69.30%,respectively,and both of them could promote the proliferation of macrophages(proliferative index=1.13～1.48),which means they were the main active polysaccharidesin Codonopsis pilosula oral solution. Compared with COP-2,HCOP-2 decreased the phagocytic capacity,TNF-αand IL-1βproduction in the concentration range of 25～400 μg/mL(p<0.05),NO and IL-6 production were significantly decreased in the concentration range of 100～400 μg/mL(p<0.05),which indicated that autoclave resulted in decrease of immune activity of Codonopsis pilosula oral solution active polysaccharide.

Codonopsispilosulaoral solution;autoclaving;polysaccharides;macrophage RAW264.7;immunocompetence

2016-12-20

余雪婷(1992-)，女，碩士研究生，研究方向：食品科學，E-mail:yuxueting1992@163.com。

*通訊作者:賀麗蘋(1965-)，女，博士，副教授，研究方向：食品質量與安全，E-mail:heliping@scau.edu.cn。

TS201.4

:A

:1002-0306(2017)12-0323-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.12.060