響應面分析法優化葫蘆素B脂質納米粒高壓均質生產工藝

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(1.北京市農林科學院蔬菜研究中心,果蔬農產品保鮮與加工北京市重點實驗室,農業部華北地區園藝作物生物學與種質創制重點實驗室,農業部都市農業(北方)重點實驗室,北京 100097; 2.沈陽農業大學食品學院,遼寧沈陽 110866)

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響應面分析法優化葫蘆素B脂質納米粒高壓均質生產工藝

劉鈺瑩1，2,趙春燕2,馬越1,趙曉燕1,張超1,*

(1.北京市農林科學院蔬菜研究中心,果蔬農產品保鮮與加工北京市重點實驗室,農業部華北地區園藝作物生物學與種質創制重點實驗室,農業部都市農業(北方)重點實驗室,北京 100097; 2.沈陽農業大學食品學院,遼寧沈陽 110866)

以葫蘆素B、脂質(單硬脂酸甘油酯)和乳化劑(泊洛沙姆188和大豆卵磷脂等比例混合物)為原料,采用高壓均質法制備葫蘆素B脂質納米粒。以單因素實驗考察均質壓力、脂質含量、乳化劑含量對葫蘆素B脂質納米粒包封率的影響,并采用響應面實驗優化葫蘆素B脂質納米粒生產工藝。結果表明:均質壓力對葫蘆素B脂質納米粒包封率的影響最大,其次為脂質和乳化劑含量。當壓力為74.8 MPa,乳化劑、脂質及葫蘆素B三者含量比為12.6∶10.3∶1時,葫蘆素B脂質納米顆粒包封率達到最高值,為92.4%,與理論值僅差1.62%,模型真實可靠。

葫蘆素B,脂質納米粒,響應面法,包封率

葫蘆素B屬于四環三萜類化合物,是葫蘆素家族中含量最豐富的一種[1-2],具有消炎、解毒、抗腫瘤、保肝、提高機體免疫力等功能[3-5]。葫蘆素B疏水性強,難溶于水或甲醇,目前有片劑和滴丸兩種劑型,但這兩種劑型會出現胃腸道不良反應,生物利用度低等問題[6-9]。脂質納米粒是指以固態的天然或合成的類脂為骨架材料,將藥物包裹于類脂中,制成粒徑為100～1000 nm的固體膠粒給藥系統,具有生物利用度高和毒性低的特點[10-13],因此可將葫蘆素B包裹于脂質納米粒中,提高其生物利用度。

高壓均質法是制備脂質納米粒的經典方法,生產出的脂質納米粒具有粒徑小、粒度分布均勻和穩定性高等特點,該工藝已經制備平均粒徑分別為400 nm的克霉唑脂質納米粒[14]、125 nm的白藜蘆醇固體脂質納米粒[15]和149 nm的水飛薊賓脂質納米粒[16],其納米粒包封率高、穩定性好。

本研究首先考察高壓均質壓力、脂質含量和乳化劑含量對葫蘆素B脂質納米粒包封率的影響,確定最佳范圍,然后采用響應面分析方法優化高壓均質法制備葫蘆素B脂質納米粒的最佳工藝參數,以期為葫蘆素B脂質納米粒的生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

葫蘆素B標準品 四川省維克奇生物科技有限公司;無水乙醇 色譜純,國藥集團化學試劑有限公司;單硬脂酸甘油酯、泊洛沙姆188、大豆卵磷脂 天津市光復精細化工研究所。

Agilent 1260高效液相色譜儀,配有四元泵及自動進樣器、DAD檢測器 Agilent公司;電熱恒溫水浴鍋 北京市永光明醫療儀器廠;KQ-500DE數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;循環水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司;MS7-H550-Pro磁力攪拌器 SCILOGEX 公司;NS1001L2K高壓均質機 意大利Niro Soavi公司。

1.2實驗方法

1.2.1 葫蘆素B脂質納米粒制備 脂質納米粒制備參考前人的方法[17-18],并進行改進。選取單硬脂酸甘油酯為脂質,泊洛沙姆188與磷脂等比例混合物為乳化劑。稱取10 mg葫蘆素B與200 mg脂質混合,水浴加熱至80 ℃作為油相;稱取100 mg混合乳化劑溶解于水中加熱至80 ℃作為水相,在磁力攪拌(1000 r/min)下,將熱的水相滴加入油相中,繼續攪拌30 min,采用高壓均質機進行均質,均質壓力85 MPa,冰水浴中冷卻,即得納米粒分散液,4 ℃冷藏備用。

1.2.2 葫蘆素B脂質納米粒包封率的測定

1.2.2.1 葫蘆素B標準曲線繪制 稱取葫蘆素B標準品0.207 g,溶于色譜級乙醇中,配制成質量濃度為2 mg/mL標準儲備液。分別稀釋至質量濃度分別為0.01、0.02、0.05、0.1和0.15 mg/mL的標準溶液,使用HPLC測定峰面積。色譜柱條件:XBridge-C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);柱溫25 ℃;流動相:A相:純水,B相:乙腈;梯度洗脫:0～30 min,50% B;30～45 min,50%～100% B;45～60 min,100%～50% B;流速1 mL/min;檢測波長228 nm[19]。以葫蘆素B的質量濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標,繪制標準曲線。

1.2.2.2 包封率的測定 準確量取葫蘆素B脂質納米粒溶液1 mL,在10000 r/min、4 ℃條件下離心30 min,收集上清液。同時,準確量取葫蘆素B脂質納米粒溶液1 mL于25 mL容量瓶中,加入20 mL乙醇,超聲波處理30 min,再使用乙醇定容至25 mL。采用HPLC測定上清液及固體脂質納米粒中葫蘆素B濃度。色譜條件同標準曲線的方法。根據式(1)計算葫蘆素B包封率[20]。

式(1)

式中:M總為葫蘆素B在脂質納米粒溶液中的總質量;M游為游離葫蘆素B的質量。

1.2.3 單因素實驗 固定脂質含量為200 mg,乳化劑含量為100 mg,考察均質壓力(40、60、80、100、120 MPa)對包封率的影響;固定脂質含量200 mg,均質壓力為80 MPa,考察乳化劑含量(50、100、200、400、800 mg)對包封率的影響；固定均質壓力為80 MPa,乳化劑含量為100 mg,考察脂質含量(50、100、200、400、600 mg)對包封率的影響。

1.2.4 響應面優化實驗 在單因素實驗的基礎上,采用響應面分析法優化制備工藝,選擇3個因素,即均質壓力、乳化劑含量及脂質含量為考察對象,以包封率為響應值,進行三因素三水平的響應面分析實驗,優化葫蘆素B脂質納米粒制備工藝,其因素水平編碼值見表1。

表1 響應面實驗因素水平表Table 1 Factors and levels table of response surface experiment

1.3數據處理與統計

實驗所有數據均有三次重復,計算平均值和標準偏差。使用統計分析軟件DPS v7.05進行處理,Ducan’s新復極差法進行顯著性分析(p≤0.05)。采用Design-Expert 軟件對所得數據進行回歸分析,圖像繪制采用Origin 8.0軟件(美國Origin Lab Corporation公司)。

2 結果與分析

2.1葫蘆素B標準曲線繪制

圖1 葫蘆素B標準曲線Fig.1 Standard curve of cucurbitacin B

圖1顯示葫蘆素B含量與峰面積呈線性關系,其回歸方程為Y=16347 X-21.8,相關性系數R2=0.9997,葫蘆素含量在0～0.20 mg/mL范圍內線性關系良好。

2.2單因素對脂質納米粒包封率的影響

2.2.1 均質壓力對葫蘆素B包封率的影響 圖2為高壓均質壓力對葫蘆素B包封率的影響。當均質壓力小于80 MPa時,隨著壓力的增加,包封率增大;超過80 MPa時,包封率隨壓力的增加而下降,原因在于當壓力過大時,產生的剪切力和空穴效應,導致了葫蘆素B納米粒破碎[21],因此,均質壓力中心值選在80 MPa附近。

圖2 均質壓力對葫蘆素B包封率的影響Fig.2 Effect of homogenization pressure on the encapsulation efficiency of cucurbitacin B

2.2.2 乳化劑含量對葫蘆素B包封率的影響 圖3為乳化劑用量對葫蘆素B納米脂質載體的包封率的影響。隨著乳化劑含量增加,乳化作用顯著提高葫蘆素B的溶解效果,葫蘆素B包封率增大;當乳化劑比例過大,會導致藥物析出,降低包封程度,因此乳化劑含量中心值選在100 mg附近,這與Kovacevic等人的研究趨勢一致[22]。

圖3 乳化劑含量對葫蘆素B包封率的影響Fig.3 Effect of the emulsifier to cucurbitacin B ratio on the encapsulation efficiency of cucurbitacin B

2.2.3 脂質含量對葫蘆素B包封率的影響 圖4為脂質含量對葫蘆素B包封率的影響。隨著脂質含量增大,葫蘆素B包封率也呈上升趨勢,在脂質含量為100 mg時,包封率達到最大值。研究顯示藥物用量一定時,加入過多的脂質會導致晶體析出,不能得到包封率較高的納米分散體系[23],與本文結論一致。因此脂質含量選在100 mg附近。

圖4 脂質含量對葫蘆素B包封率的影響Fig.4 Effect of lipid to cucurbitacin B ratio on the encapsulation efficiency of cucurbitacin B

2.3響應面實驗分析

2.3.1 回歸模型的建立及方差分析 研究選取均質壓力、乳化劑含量、脂質含量作為響應面實驗因素,以葫蘆素B脂質納米粒包封率為響應值,運用Design-Expert 軟件設計響應面實驗,設計方案及結果見表2所示。

表2 響應面實驗設計結果Table 2 Experiment result of response surface methodology

對表2實驗數據進行多元回歸分析,得到各因子對葫蘆素B提取率影響的二次回歸模型:Y=50.22+0.27A+7.96B+2.63C+7.22AB+0.28AC+6.43BC-9.83A2+12.58B2+3.36C2。

對響應面分析結果進行方差分析(表3),模型的p=0.0021<0.01,該模型極顯著,方差的失擬項不顯著p=0.1700>0.05,說明表面模型回歸擬合較好;決定系數R2=0.9747,說明葫蘆素B包封率與模型回歸值有較好的一致性[24-27]。

各因素對葫蘆素B包封率影響排序為:壓力>脂質含量>乳化劑含量。A、AB、AC、A2、B2對葫蘆素B包封率有顯著影響(p<0.05),其余因子均不顯著;各因素對葫蘆素B包封率的影響不是簡單的線性關系。

表3 擬合二次多項式模型的方差分析Table 3 Variance analysis for the fitted quadratic polynomial model

圖5 條件參數交互作用對葫蘆素B脂質納米粒包封率的影響Fig.5 Response surface plots for the interactive of 3 factors on the encapsulation efficiency cucurbitacin B

注：*,影響顯著(p<0.05),**,影響極顯著(p<0.01)。2.3.2 各因素交互作用的影響 均質壓力、乳化劑含量、脂質含量對包封率的交互影響見圖5。均質壓力對葫蘆素B包封率影響最顯著,脂質含量次之,乳化劑含量影響最小。圖5可知,當脂質含量一定時,在不同乳化劑含量條件下,隨著壓力的增大,包封率呈先急速上升而后下降的趨勢;當乳化劑含量一定時,在不同脂質含量條件下隨著壓力的增大,葫蘆素B包封率呈上升趨勢;當壓力一定時,在不同乳化劑含量條件下,脂質含量的變大會導致葫蘆素B包封率的增加。

2.3.3 葫蘆素B脂制裁納米最優制備條件與驗證 回歸模型分析得出最佳生產工藝為:當壓力為74.8 MPa;乳化劑含量為126 mg;脂質含量103 mg時,葫蘆素B脂質納米粒的包封率可達92.4%。驗證實驗結果顯示葫蘆素B脂質納米粒的包封率90.9%,實際值與理論值的相對偏差僅為1.62%,模型真實可靠。

3 結論

響應面回歸模型顯示均質壓力對葫蘆素B脂質納米粒包封率影響最大,其次是脂質含量和乳化劑含量,當均質壓力為74.8 MPa,乳化劑、脂質及葫蘆素B的比例為12.6∶10.3∶1時,即泊洛沙姆188含量為63 mg,大豆卵磷脂含量63 mg,單硬脂酸甘油酯含量103 mg,葫蘆素B 10 mg,葫蘆素B脂質納米粒包封率可達92.4%,與理論值僅差1.62%,模型真實可靠。

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OptimizationofsolidlipidnanoparticleofcucurbitacinBbyresponsesurfacemethodology

LIUYu-ying1,2,ZHAOChun-yan2,MAYue1,ZHAOXiao-yan1,ZHANGChao1,*

(1.Beijing Vegetable Research Center,Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Beijing Key Laboratory of Fruits and Vegetable Storage and Processig,Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops(North China),Ministry of Agriculture, Key Laboratory of Ubran Agriculture(North),Ministry of Agriculture,Beijing 100097,China; 2.College of Food Science,Shenyang Agricultural University,Shenyang 110866,China)

The solid lipid nanoparticle of cucurbitacin B was prepared by high pressure homogenization with the lipid of monoglyceride,the emulsifier of mixture of the soybean lecithin and poloxamer 188(1∶1). The parameters of the high pressure homogenization were optimized by response surface methodology with the homogenization pressure,lipid content and emulsifier content as the main factors,and the encapsulation efficiency as the response. The homogenization pressure was the key factor affecting the encapsulation efficiency of cucurbitacin B,followed by the lipid content and emulsifier content. When the homogenization pressure was 74.8 MPa,and the ratio of the lipid-emulsifier-cucurbitacin B was 12.6∶10.3∶1,the encapsulation efficiency of cucurbitacin B reached the maximum of 92.4%. The validation experiment showed that the relative deviation between real and theoretical value was only 1.62%. The regression model was reliable.

cucurbitacin B;solid lipid nanoparticles;response surface methodology;encapsulation efficiency

2016-11-04

劉鈺瑩(1992-)，女，碩士研究生，研究方向：農產品深加工，E-mail：18515344964@163.com。

*通訊作者:張超(1978-)，男，博士，副研究員，研究方向：果蔬深加工，E-mail：zhangchao@nercv.org。

現代農業產業技術體系建設專項資金(CARS-26)；北京市農林科學院科技創新能力建設專項(KJCX20170205)；果蔬農產品保鮮與加工北京市重點實驗室專項(Z141105004414037)。

TS201.2

:B

:1002-0306(2017)12-0254-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.12.046