響應面法優化莧紅素提取工藝及其抗氧化性

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(寧波大學食品科學與工程系,浙江寧波 315211)

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響應面法優化莧紅素提取工藝及其抗氧化性

熊茜,王春幸,孫朦,王凱凱,宋佳敏,許鳳*,王鴻飛

(寧波大學食品科學與工程系,浙江寧波 315211)

彩莧,莧紅素,響應面優化法,抗氧化性

莧菜又名米莧、赤莧、彩莧、青香莧、雁來紅等,系莧科莧屬一年生植物莧的莖葉。莧菜按其顏色分為紅莧、綠莧和彩莧三種,在我國南北各地均有栽培,是夏季的主要蔬菜之一[1]。隨著人們消費觀念的變化,在滿足蔬菜產品數量的同時,開始追求產品的內在營養、保健食療價值,要求無污染、食用安全、方便等[2]。莧菜營養豐富,是一種十分優良的菜、糧、藥兼用作物?，F代醫學和營養學研究表明,莧菜含有礦物質元素鋅、鈣、鉀、鈉等;維生素C、維生素E和維生素K以及18種氨基酸等,其中包括人體必需的8種氨基酸[3-4]。

莧菜中所含的莧紅素是一種易溶于水的含氮有機物[5],它不同于花青素,屬于甜菜素類中甜菜紅素亞型的生物色素[6]。莧紅素色澤鮮艷,安全無毒,是天然的食用色素,具有預防心血管疾病和某些癌癥、保護視力、抗氧化、抗衰老、抗潰瘍、抗炎等生理和藥理作用[7-8]。目前,合成色素莧菜紅廣泛用于食品、飲料、藥品、化妝品、煙草、飼料、食品包裝材料等的著色[9],以天然莧紅素取代合成色素,因其更符合現代消費者的消費需求,并具有廣闊的市場前景。劉德良[10]以2%鹽酸作為提取溶劑提取紅莧草中的莧紅素,廖芙蓉[11]等以籽粒莧花穗為原料,采用超聲波輔助提取法,以10%乙醇作為溶劑提取其色素。

生物體內自由基種類繁多,以活性氧為主?；钚匝踝杂苫?Reactive Oxygen Species,ROS)會導致蛋白質損傷、酶失活、膜脂過氧化等,從而引起機體衰老,誘發腫瘤等惡性疾病。尋找適當的外源性抗氧化劑,清除體內的自由基,對保持自由基穩衡性動態,治療疾病和保護人體健康很有益處。有研究表明,野莧菜具有潛在的抗氧化活性[12-15]。本文以市售蔬菜彩莧為原料,采用響應面法優化莧紅素的提取工藝,并在前人研究的基礎上,對其抗氧化性開展進一步的研究,為天然莧紅素的充分利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

彩莧 購于寧波莊市菜市場,選取新鮮、無病蟲害的葉片進行實驗;乙醇、鹽酸等 均為分析純;甜菜苷紅色素標準品(純度 ≥ 99%)、2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)、硫酸亞鐵、1,1-二硝基苦基苯肼(DPPH)、鄰菲羅啉、鄰苯三酚 國藥集團化學試劑有限公司。

754型紫外分光光度計 上海美譜達科技有限公司;GL-16G-Ⅱ型離心機 湖南長沙湘儀離心機儀器有限公司;水浴鍋、烘箱 上海精宏實驗設備有限公司;PHS-3C型pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 原料制備 將買來的彩莧去根,保留地上的部分,洗凈,瀝干表面水分后,50 ℃烘干,粉碎后過60目篩,保存于干燥避光處備用[16]。精確稱取1.0 g干燥的莧菜粉于燒杯中,加入蒸餾水40 mL,置于30 ℃的水浴鍋中浸提1 h后對其進行抽濾,得到的濾液即為莧紅素提取液。

1.2.2 確定最大吸收波長 將提取出的莧紅素濾液用蒸餾水定容至100 mL,倒入光徑1 cm的比色皿中,用可見分光光度計在400～700 nm的波長下進行波長掃描,確定其最大吸收光譜[17]。

1.2.3 莧紅素標準曲線的測定及得率的計算方法 稱取甜菜苷紅色素標準樣品0.2000 g,用水溶解定容至1000 mL,搖勻得濃度為0.20 mg/mL的莧紅素標準儲備液,加水配制成濃度分別為0、4、8、12、16、20 μg/mL的溶液,于最大吸收波長處測定其吸光度值。以溶液濃度為橫坐標,吸光度值為縱坐標,繪制甜菜苷紅色素的標準曲線圖[18]。莧紅素標準曲線為Y=0.0103X-0.0011,R2=0.9996。

莧紅素得率(%)=莧紅素含量/莧菜粉的質量×100

式(1)

其中,莧紅素含量根據莧紅素標準曲線計算得到。

1.2.4 提取溶劑種類對莧紅素提取效果的影響 在提取溫度為40 ℃,提取時間為30 min,料液比為1∶30的條件下,分別采用水、無水乙醇、50%乙醇、pH 6.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、2%鹽酸作為提取劑進行提取。考察不同溶劑對莧紅素提取效果的影響,從而確定最合適的提取劑。

1.2.5 莧紅素提取的單因素實驗條件優化 實驗選擇料液比、提取時間、提取溫度作為莧紅素提取效果的主要影響因素,以莧紅素得率為考察指標,進行單因素實驗。

準確稱取6份1 g干燥的莧菜粉,分別加入10、20、30、40、50、60 mL提取劑進行提取,在40 ℃水浴鍋中放置30 min后抽濾,取一定量濾液高速(10000 r/min)冷凍離心10 min,得到的上清液用水稀釋后于538 nm處測定吸光度值。

準確稱取6份1 g莧菜粉,加入40 mL提取劑進行提取,在溫度為40 ℃的水浴鍋中分別放置10、30、50、70、90、110 min后,進行以上相同的處理,于538 nm處測定吸光度值。

準確稱取6份1 g莧菜粉,加入40 mL提取劑進行提取,分別在溫度為20、30、40、50、60、70 ℃的水浴鍋中浸提50 min后,進行以上相同的處理,于538 nm處測定吸光度值。

1.2.6 響應面法優化莧紅素提取工藝 根據單因素實驗結果,以提取時間(A)、提取溫度(B)、料液比(C)為實驗因素,以莧紅素得率作為響應值,進行Box-Benhnken實驗設計,實驗因素水平及編碼見表1。

表1 Box-Benhnken響應面優化實驗因素水平表Table 1 The factors and levels table of Box-Benhnken experiment

1.2.7 莧紅素抗氧化性的研究

1.2.7.1 莧紅素總抗氧化能力的測定 本實驗參照[19-20]的方法,采用FRAP法對莧紅素的總抗氧化能力進行測定。

還原力標準曲線的繪制:分別取 0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mmol/L的FeSO4溶液3 mL,加入3 mL FRAP工作液,混勻后于37 ℃反應10 min,于593 nm處測定吸光度值。以FeSO4溶液的濃度為橫坐標,吸光度值為縱坐標繪制標準曲線。

樣品總抗氧化能力的測定:在最優條件下提取出莧紅素溶液,并將其稀釋成濃度分別為0.07、0.08、0.09、0.10、0.12、0.15、0.20 mg/g的待測液,同時配制相同濃度VC溶液作為對照,按照繪制標準曲線的方法測定吸光度值,抗氧化化活性以相同吸光度值的FeSO4溶液來表示。

1.2.7.2 莧紅素清除DPPH自由基能力的測定 莧紅素清除DPPH自由基能力的測定方法參照董迪迪等[21]的方法有所改動。將提取出的莧紅素稀釋成濃度分別為0.10、0.14、0.18、0.27、0.34、0.45、0.55、0.68 mg/g的溶液(同時配制相同濃度的VC溶液)。向試管中加入樣品液1 mL及0.02 mmol/L DPPH溶液2 mL,混合均勻后于暗處靜置30 min,乙醇做參比,在517 nm處測定吸光度值A2;同樣的操作,用等體積的蒸餾水代替樣品液,測定吸光度值A0;不加DPPH,用等體積乙醇代替,分別加入1 mL不同濃度的樣品液,同法操作測定吸光度值A1,按以下公式計算清除率:

式(2)

1.2.7.3 莧紅素清除羥基自由基能力的測定 本實驗采用Feton法中的分光光度法測定莧紅素清除羥基自由基的能力[17]。將提取出的莧紅素稀釋成濃度分別為0.01、0.03、0.05、0.07、0.09、0.10 mg/g的溶液(同時配制相同濃度的VC溶液)。試管中依次加入2 mL pH7.4 PBS緩沖液、1 mL 0.75 mmol/L鄰菲羅啉溶液、1 mL 0.75 mmol/L FeSO4溶液、1.5 mL樣品液、0.5 mL 0.01%雙氧水,混合均勻后于536 nm測定吸光度值A2;用等體積的蒸餾水代替樣品液和雙氧水,相同的方法測定吸光度值A0;不加樣品液,用等體積的蒸餾水代替,測定吸光度值A1,按以下公式計算清除率:

式(3)

1.2.7.4 莧紅素清除超氧陰離子自由基能力的測定 本實驗采用鄰苯三酚的自氧化作用建立超氧陰離子體系。

鄰苯三酚自氧化速率的測定[22]:在試管中加入4.5 mL 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.2,在37 ℃水浴鍋中預熱20 min)和4 mL蒸餾水,混勻后于37 ℃水浴鍋中保溫20 min后取出,立即加入0.5 mL已在37 ℃條件下預熱的3 mmol/L鄰苯三酚溶液,反應1 min后,迅速倒入比色皿中,以10 mmol/L HCl溶液配制空白管作為對照,325 nm處每隔30 s測其吸光度。以時間為橫坐標,吸光度值為縱坐標線性回歸,其斜率為鄰苯三酚自氧化的反應速率(V0)。

樣品清除超氧陰離子自由基能力的測定[23]:將提取出的莧紅素稀釋成不同濃度分別為0.14、0.17、0.20、0.35、0.5、0.7 mg/g的溶液(同時配制相同濃度的VC溶液),按上述步驟,在加入鄰苯三酚之前加入4 mL不同濃度的待測液代替蒸餾水。于325 nm處每隔30 s測定吸光度值,按相同的方法線性回歸,曲線斜率記為V1。按以下公式計算抑制率:

式(4)

1.3數據處理

樣品取樣3次,進行實驗。數據均取3次重復的平均值,采用IBM SPSS V 19.0軟件分析實驗數據,平均值的差異性用單因素方差分析(one-way ANOVA)中的Duncan’s檢驗,p<0.05為有統計學差異。使用Origin 8.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1提取溶劑種類對莧紅素提取效果的影響

圖1反映了不同提取溶劑對莧紅素得率的影響,從圖中可以看出,5種提取劑對莧紅素得率依次為:50%乙醇>水>pH 6.0緩沖液>無水乙醇>2%鹽酸。但由于莧菜葉片中的葉綠素能夠溶于50%的乙醇中,而且葉綠素a的最大吸收光的波長在420～663 nm,葉綠素b的最大吸收波長范圍在460～645 nm[24],會對莧紅素的測定產生一定影響,綜合考慮,選擇水作為莧紅素的提取劑。

圖1 不同提取劑對莧紅素提取效果的影響Fig.1 Effect of different solvent on extraction of amaranthin注:不同字母表示差異性顯著。

2.2單因素實驗條件優化

2.2.1 料液比對莧紅素提取效果的影響 由圖2可知,增加料液比可以顯著提高莧紅素得率,提高提取效果,當料液比達到1∶40時,莧紅素已基本溶出,繼續增大料液比,不但會增加溶劑的用量,而且會增大去除溶劑所需負荷,因此,從莧紅素得率和節約成本兩方面考慮,確定料液比為1∶40。

圖2 不同料液比對莧紅素提取效果的影響Fig.2 Effect of different solid-liquid ratio on extraction of amaranthin

2.2.2 提取時間對莧紅素提取效果的影響 由圖3可以看出,隨著提取時間的延長,莧紅素得率逐漸增多,在50 min時達到峰值,超過50 min后,莧紅素得率開始下降,可能是因為部分色素在提取的過程中被分解,因此,莧紅素得率的提取時間應控制在50 min左右為宜。

圖3 不同提取時間對莧紅素提取效果的影響Fig.3 Effect of different time on extraction of amaranthin

2.2.3 提取溫度對莧紅素提取效果的影響 圖4反映出提取溫度對莧紅素得率的影響,當溫度低于30 ℃時,莧紅素得率隨提取溫度的升高而平緩增大,但當溫度超過30 ℃時,隨溫度的升高莧紅素得率呈下降的趨勢,溫度超過50 ℃時,由于色素熱穩定性較差,在高溫下產生分解而導致莧紅素得率急劇下降。因此,莧紅素的提取溫度宜控制在30 ℃以下。

表3 回歸模型的方差及顯著性分析Table 3 Regression model of variance and significant analysis

圖4 不同提取溫度對莧紅素提取效果的影響Fig.4 Effect of different temperature on extraction of amaranthin

注:*:差異顯著,p<0.05;**:差異極顯著,p<0.01。2.3響應面法優化莧紅素得率提取工藝

2.3.1 響應面分析優化實驗 表2中實驗共17組,其中12組為析因實驗,其余5組為中心實驗,用于實驗誤差的估計,采用Design Expert軟件對實驗數據進行回歸分析,得到莧紅素得率關于提取時間(A),提取溫度(B)和料液比(C)等因素的二次多項回歸方程:

莧紅素得率Y=-0.32871+0.073608A+0.087521B+0.011324C-2.0712×10-4AB-3.3333×10-4AC-3.68933×10-4BC-5.72493×10-4A2-9.96441×10-4B2+2.17149×10-4C2

表2 響應面優化實驗設計及實驗結果Table 2 Experimental design and results of optimizing test with response surface method

2.3.3 響應面的曲面分析 將提取時間,提取溫度、料液比3個參數分別固定,莧紅素得率隨其余兩個參數變化趨勢如圖5～圖7所示。響應面中等高圖直觀地反映出各因素交互作用對響應值的影響,圓形表示二因素交互作用不顯著,橢圓表示二因素交互作用顯著[25]。

圖5 提取時間和提取溫度的響應曲面圖Fig.5 Response surface plot of extraction time and extraction temperature

圖6 提取時間和料液比的響應曲面圖 Fig.6 Response surface plot of extraction time and solid-liquid ratio

圖7 提取溫度和料液比的響應曲面圖Fig.7 Response surface plot of extraction temperature and solid-liquid ratio

提取溫度和提取時間對提取出的莧紅素得率呈近似橢圓形(圖5),說明兩者之間有交互作用,當提取時間一定時,莧紅素得率隨提取溫度的升高呈現先增加后減小的趨勢,在溫度為30～35 ℃的范圍內莧紅素得率較好。當提取溫度一定時,提取出的莧紅素的量隨提取時間的變化較小。而從圖6、圖7中的等高線可以看出,提取時間和料液比之間或者提取溫度和料液比之間交互作用較小,可能是料液比在該實驗范圍內對莧紅素得率影響較小。

通過回歸模型的分析,可以確定莧紅素得率的最佳工藝條件為提取溫度為30.06 ℃、提取時間為44.34 min、料液比為1∶50。在此條件下,模型預測提取出的莧紅素得率為3.08 mg/g。為方便實際操作,將工藝條件修正為溫度為30 ℃、時間為44 min、料液比為1∶50。為檢驗該響應面優化方法的可靠性,采用上述最佳條件測定莧紅素得率,實際得到的莧紅素得率為3.05 mg/g,與理論預測值相比誤差為0.98%。因此,采用響應面優化莧紅素得率的工藝條件闡述準確可靠,具有實用價值。

2.4莧紅素抗氧化性研究

莧菜中莧紅素的抗氧化性研究結果如圖8所示。由圖8(A)可知,莧紅素和VC都具有較好的抗氧化能力,并且隨著濃度的增加,抗氧化能力越來越強,當濃度高于0.15 mg/g時,兩者的抗氧化能力都趨于平衡,隨濃度變化不大。在實驗濃度范圍內莧紅素的抗氧化能力均高于VC。結合總抗氧化能力標準曲線可以得出0.15 mg/g莧紅素溶液的抗氧化能力相當于0.09 mmol/L FeSO4,而相同濃度的VC溶液則相當于0.07 mmol/L FeSO4溶液。

圖8(B)反映出莧紅素對DPPH自由基的清除能力。在0.1～0.55 mg/g的范圍內,莧紅素對DPPH自由基的清除能力隨其濃度的增加而增強,超過0.55 mg/g后,清除能力隨濃度變化不大。而VC作為對照,在其濃度介于0.1～0.45 mg/g時,其清除能力顯著低于(p<0.05)莧紅素,繼續提高其濃度,兩者清除效果相當且變化不大。DPPH自由基清除力的大小通常用半清除率(IC50)表示,IC50是當清除率達到50%時所需要的抗氧劑濃度[22]。因此,根據清除率擬合曲線得到莧紅素和VC的IC50分別為0.18 mg/g和0.40 mg/g。

莧紅素對羥基自由基的清除作用如圖8(C)所示。莧紅素和VC都具有良好的清除羥基自由基的能力,在低濃度時,VC對羥基自由基的清除效果要優于莧紅素,隨著濃度的增加,當濃度大于0.06 mg/g時,莧紅素的清除能力反而高于VC,但二者的清除率都趨于平衡,隨濃度的增加變化不大,與郝秀梅[26]等研究結果一致。根據清除率擬合曲線得到莧紅素和VC的IC50分別為0.06 mg/g和0.11 mg/g。

與王寧[27]等研究結果相似,在濃度低于0.6 mg/g時,莧紅素對超氧陰離子自由基的清除作用強于VC,且隨著濃度的增加,清除率也隨之增大。當濃度高于0.6 mg/g時,VC的清除能力超過莧紅素(圖8D)。根據清除率擬合曲線得到莧紅素和VC的IC50分別為0.35 mg/g和0.48 mg/g。

圖8 莧紅素抗氧化性研究結果Fig.8 Results of study of amaranthin antioxidant注:A:總抗氧化能力;B:DPPH自由基清除率;C:羥基自由基清除率;D:超氧陰離子自由基清除率; “**”和“*”分別表示相同濃度的VC與莧紅素溶液的抗氧化性在 0.01水平(雙側)和0.05水平(雙側)上顯著相關。

3 結論

利用響應面優化法得到提取莧菜中莧紅素的最佳工藝條件為H2O作為提取劑、提取時間為44 min、提取溫度為30 ℃、料液比為1∶50。影響提取最顯著的因素是提取溫度,其次是提取時間,最后是料液比。在此最優條件下,莧紅素得率為0.305%。莧紅素具有較好的抗氧化能力,其對DPPH自由基的清除率及總抗氧化能力均優于相同濃度的VC溶液,對羥基自由基以及超氧陰離子自由基的清除率也與VC相差不大。研究得出,0.15 mg/g莧紅素提取液的總抗氧化能力相當于0.09 mmol/L FeSO4,對DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基的IC50分別為0.18、0.06和0. 35 mg/g。

[1]趙秀玲. 莧菜的營養成分與保健功能[J]. 食品工業科技,2010(8):391-393.

[2]玄永浩,金銀哲,劉旭,等. 莧菜藥理作用研究進展[J]. 長江蔬菜,2010,22:1-4.

[3]吳時敏. 莧菜的開發利用[J]. 農村實用工程技術,1999(3):29-30.

[4]張普慶,鄧淑娥,張新閩,等. 野莧菜氨基酸含量與營養評價[J]. 氨基酸和生物資源,1998,20(1):38-39.

[5]Chauhan S P,Sheth N R,Rathod I S,et al. Analysis of betalains from fruits of Opuntia species[J]. Phytochemistry Reviews,2013,12(1):35-45.

[6]Stintzing F C,Schieber A,Carle R. Betacyanins in fruits from red-purple pitaya. Hylocereus polyrhizus,(Weber)Britton & Rose[J]. Food Chemistry,2002,77(1):101-106.

[7]金同銘. 莧菜的營養特色與保健作用[J]. 蔬菜,1998,25(4):25-26.

[8]趙海軍,汪朝陽,侯曉娜,等. 天然紅色素的提取研究進展[J]. 廣州化學,2008,33(3):32-39.

[9]唐業昌. 野莧菜營養豐富[J]. 中國蔬菜,1989,21(1):38-40.

[10]劉德良. 紅莧草色素提取工藝及穩定性研究[J]. 湖北農業科學,2012,51(1):143-145.

[11]廖芙蓉,闞建全,熊麗娜. 響應面法優化超聲波輔助提取籽粒莧花穗色素工藝[J]. 食品科學,2013,34(2):93-98.

[12]Ozsoy N,Yi Lmaz T,Kurt O,et al.Invitroantioxidant activity of Amaranthus lividus L[J]. Food Chemistry,2009,116(4):867-872.

[13]Tikekar R V,Ludescher R D,Karwe M V. Processing stability of squalene in amaranth and antioxidant potential of amaranth extract[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry,2008,56(22):10675-10678.

[15]Chon S U,Heo B G,Park Y S,et al. Total Phenolics Level,Antioxidant Activities and Cytotoxicity of Young Sprouts of Some Traditional Korean Salad Plants[J]. Plant Foods for Human Nutrition,2009,64(1):25-31.

[16]姜雪. 堿蓬色素提取及應用研究[D].遼寧：大連工業大學,2013.

[17]陳冠林,胡坤,鄧曉婷,等. 紅肉火龍果果皮色素的純化及穩定性的研究[J]. 中國農學通報,2012,28(27):277-282.

[18]岳鹍,潘志恒,劉鵬,等. 超聲波輔助提取火龍果果皮紅色素工藝研究[J]. 食品研究與開發,2015(19):68-70.

[19]Zhang Z,Lv G,He W,et al. Effects of extraction methods on the antioxidant activities of polysaccharides obtained from Flammulina velutipes[J]. Carbohydrate Polymers,2013,98(2):1524-1531.

[20]馬淑鳳,王利強,胡志超,等. 酶法提取白靈菇深層發酵菌絲體多糖的研究[J]. 農業工程學報,2006,22(9):198-201.

[21]董迪迪,王鴻飛,周增群,等. 楊梅籽油抗氧化活性及其調節血脂作用的研究[J]. 中國糧油學報,2014,29(5):53-57.

[22]Zhang H,Ma H,Liu W,et al. Ultrasound enhanced production and antioxidant activity of polysaccharides from mycelial fermentation of Phellinus igniarius[J]. Carbohydrate Polymers,2014,113:380-387.

[23]楊娜,王鴻飛,郝艷佳,等. 裂褶菌多糖提取工藝及抗氧化活性研究[J]. 中國食品學報,2014,14(8):92-98.

[24]何若韞. 葉綠素含量測定[J]. 新農業,1980(3):33-34.

[25]石恩慧,李紅,賈昌喜,等. 板栗總苞多酚提取工藝優化及其抗氧化性研究[C]. 中國畜牧獸醫學會動物營養學分會第十一次全國動物營養學術研討會論文集[R]. 2012:406-414.

[26]郝秀梅. 甜菜紅色素的分離純化及抗氧化與抗疲勞活性的研究[D]. 哈爾濱:東北林業大學,2011.

[27]王寧,薛源,孫體健. 莧菜紅色素對羥自由基和超氧陰離子自由基的清除作用[J]. 山西醫科大學學報,2009,40(5):458-460.

Responsesurfacemethodologyforoptimizingextractionofamaranthinanditsantioxidantactivity

XIONGQian,WANGChun-xing,SUNMeng,WANGKai-kai,SONGJia-min,XUFeng*,WANGHong-fei

(College of Food Science and Engineering,Ningbo University,Ningbo 315211,China)

AmaranthustricolorL.;amaranthin;response surface methodology;antioxidant activity

2016-12-30

熊茜(1991-)，女，碩士研究生，研究方向:農產品貯藏加工,E-mail:13646621631@163.com。

*通訊作者:許鳳(1983-)，女，博士，副教授，研究方向:農產品貯藏加工,E-mail：xufeng1@nbu.edu.cn。

國家自然科學基金青年科學基金項目(31301574)；浙江省自然科學基金項目(Y16C200011)；浙江省科技廳項目(2014C02023)；寧波市自然科學基金項目(2015A610273)；寧波大學人才引進項目(ZX2012000031)；寧波大學學科項目(xkl1344)；寧波大學?？蒲谢痦椖?XYL14025)；寧波大學學科項目(xkzsc1526)。

TS255.1

:B

:1002-0306(2017)12-0221-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.12.040