響應面法優化龍須菜蛋白酶解工藝及酶解液的抗氧化活性

,,,,,

(魯東大學食品工程學院,山東煙臺 264025)

?

響應面法優化龍須菜蛋白酶解工藝及酶解液的抗氧化活性

于慧,劉海梅,李蒙娜,林詩琪,魏飛龍,郭鴻陽

(魯東大學食品工程學院,山東煙臺 264025)

為獲得高抗氧化活性的龍須菜蛋白酶酶解液,運用響應面(RSM)分析方法對龍須菜蛋白酶解工藝條件進行優化。經單酶篩選,在單因素實驗基礎上,以亞鐵離子螯合率和DPPH自由基清除率為主要指標,水解度為輔助指標,研究酶解時間、pH、酶解溫度、底物質量濃度、加酶量對龍須菜蛋白酶解液抗氧化活性和水解度的影響。結果表明:在所選的5種蛋白酶中,復合蛋白酶是龍須菜蛋白酶解的最適用酶;酶解液抗氧化活性的最優酶解條件為酶解時間8.1 h、酶解溫度50.1 ℃、pH7.0、底物濃度10 g/L、加酶量0.1%(0.15 AU/g)。在此條件下,酶解液的亞鐵離子螯合率為74.61%,DPPH自由基清除率為47.66%,水解度為17.58%。對比常用抗氧化劑,酶解液在亞鐵離子螯合能力方面顯著高于0.01%維生素C和0.01% BHA(p<0.05),而在DPPH自由基清除能力和還原能力方面,酶解液低于0.01%維生素C和0.01% BHA(p<0.05)。優化后的龍須菜蛋白酶酶解液具有一定的抗氧化活性。

龍須菜,酶解,響應面,抗氧化活性,水解度

龍須菜(Gracilarialemaneiformis)又名江蘺、鳳菜、海菜等,屬于紅藻門、真紅藻綱、杉藻目、江蘺科、江蘺屬,是一種紅藻類海洋植物[1-2],含有多種營養物質,除多糖和粗纖維外,其蛋白質含量約占藻體的19%,僅次于紫菜[3]。在我國龍須菜養殖規模大、產量高且生產成本低,是我國重要的經濟藻類,主要集中在山東、福建、浙江、廣東、海南省等沿海地區[3]。它既是食品工業中提煉瓊脂的主要原料,又可以作為優質飼料來養殖鮑魚,還可以成為人類的綠色保健食品[3],在食用、藥用、科學研究、生物、水產養殖方面都有其獨特的應用價值。目前,關于龍須菜活性物質的研究主要集中于其多糖[4]。

表1 不同蛋白酶水解實驗條件Table 1 Experimental conditions for different proteases

抗氧化多肽通常由3～20個氨基酸殘基組成,具有螯合金屬離子、抑制和延緩脂質氧化,以及保護人體組織器官免受自由基侵害等作用。食源性蛋白質通過水解作用得到的抗氧化多肽具有抗氧化性強、安全性高和易被吸收等特點,因此在食品行業中引起了廣泛的關注[5-6]。尤其近幾年,由于海藻的氨基酸組成均衡,有關其生物活性多肽的研究也極為活躍,研究人員已從海藻中分離得到多種可清除體內自由基,具有抗氧化作用的海藻活性肽[7-9],但其主要集中在螺旋藻、紫菜等蛋白質含量較高的藻類中,而其他藻類的蛋白酶解研究極其少見。據報道[10],藻類在工業生產過程中,有大量的以蛋白質為主體的廢棄物產生,為了提高資源的有效利用率,本團隊在裙帶菜的蛋白酶解研究中發現了其蛋白酶酶解液具有較好的亞鐵離子螯合能力和DPPH自由基清除能力[11]。而龍須菜的蛋白質含量雖然低于紫菜,但比裙帶菜高,有關龍須菜蛋白酶解多肽的研究也極少見,因此,本實驗利用復合蛋白酶水解龍須菜蛋白,在單因素實驗基礎上,運用響應面分析法對水解工藝條件進行優化并研究酶解液的抗氧化活性,旨在為酶解制備生物活性肽和龍須菜的深加工提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

龍須菜(Gracilarialemaneiformis) 采于山東日照，使用前清洗、凍干、粉碎并過80目篩后置于-18 ℃保存用(蛋白質含量為17.39%);復合蛋白酶(Protamex)(1.5 AU/g) 丹麥諾維信有限公司;Alcalase(2.4 AU/g) 南京誠納化工有限公司;胃蛋白酶(3000 U/g) 上海藍季科技發展有限公司;胰蛋白酶(50000 U/g) 國藥集團化學試劑有限公司;木瓜蛋白酶(25 U/g) 北京奧博星生物技術有限責任公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 上海化成工業發展有限公司；菲洛嗪 美國Sigma公司;維生素C、三氯乙酸、三氯化鐵、鐵氰化鉀、無水乙醇等 均為分析純。

pB-10型pH計 新銳儀表儀器有限公司;ZHWY-1102雙層恒溫培養振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司;LGJ-18S真空冷凍干燥機 北京松源華興科技發展有限公司;XMTD-2MA電熱恒溫水浴鍋 山東省龍口市先科儀器公司;TDL-5-A離心機 上海安亭科學儀器廠;XW-80A微型旋渦混合儀 上海滬西分析儀器廠有限公司;721型可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 龍須菜粗蛋白酶解工藝流程 龍須菜粉末→加磷酸緩沖溶液→保溫酶解→滅酶(85 ℃,15 min)→離心(5000 r/min，20 min)→取上清液得到酶解液

1.2.2 最佳酶種類的選擇 參照文獻[12]所述方法,稱取1 g龍須菜粉末于250 mL錐形瓶中,加入100 mL磷酸緩沖溶液攪拌均勻,分別向其加入100 mg胰蛋白酶、胃蛋白酶、Alcalase 2.4L、復合蛋白酶及木瓜蛋白酶,按表1所示,在其各自最適條件下酶解8 h。85 ℃滅酶15 min,離心(5000 r/min,10 min),取上清液測定其亞鐵離子螯合率、DPPH自由基清除率及水解度。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 最佳酶解時間的確定 以優選的復合蛋白酶為水解酶,在底物質量濃度10 g/L,加酶量0.1%,酶解溫度50 ℃,pH7.0的條件下,選取酶解時間分別為2、4、6、8、10 h,研究酶解時間對亞鐵離子螯合能力、DPPH自由基清除能力和水解度的影響。

1.2.3.2 最適pH的確定 以優選的復合蛋白酶為水解酶,在酶解時間為8 h,底物質量濃度10 g/L,加酶量為0.1%,酶解溫度50 ℃的條件下,選取pH分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5,研究pH對亞鐵離子螯合能力、DPPH自由基清除能力和水解度的影響。

1.2.3.3 最適酶解溫度的確定 以優選的復合蛋白酶為水解酶,在酶解時間為8 h,pH7.0,底物質量濃度10 g/L,加酶量0.1%的條件下,選取酶解溫度分別為35、40、45、50、55 ℃,研究酶解溫度對亞鐵離子螯合能力、DPPH自由基清除能力和水解度的影響。

1.2.3.4 最適底物濃度的確定 以優選的復合蛋白酶為水解酶,在酶解時間為8 h,酶解溫度50 ℃,pH7.0,加酶量為0.1%的條件下,不同底物質量濃度分別為1、2、5、10、15 g/L,研究底物質量濃度對亞鐵離子螯合能力、DPPH自由基清除能力和水解度的影響。

1.2.3.5 最適加酶量的確定 以優選的復合蛋白酶為水解酶,在酶解時間為8 h,底物質量濃度為10 g/L,酶解溫度50 ℃,pH7.0的條件下,選取酶的添加量分別為0.02%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%,研究加酶量對亞鐵離子螯合能力、DPPH自由基清除能力和水解度的影響。

1.2.4 響應面分析實驗 在單因素實驗基礎上,運用Box-Behnken的中心組合實驗設計原理,以酶解時間(A)、pH(B)、酶解溫度(C)為自變量,DPPH自由基清除率和亞鐵離子螯合率為響應值,進行三因素三水平的響應面實驗,因素水平設計見表2。

表3 不同蛋白酶對龍須菜蛋白酶解效果的影響Table 3 Effect of protease type on hydrolysis efficiency of Gracilaria lemaneiformis protein

注:同列字母不同表示差異顯著(p<0.05);表6同。

表2 Box-Behnken實驗設計Table 2 Box-Behnken experimental design

1.2.5 水解度的測定 采用甲醛滴定法[13]。

1.2.6 酶解液DPPH自由基清除能力的測定 參照文獻[14]所述方法,將2 mL龍須菜蛋白酶酶解液加入到含2 mL 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液的試管中,迅速混勻,并在室溫下暗處反應30 min,測定517 nm波長處的吸光度。同時以2 mL磷酸緩沖溶液取代龍須菜蛋白酶酶解液的試管為對照實驗;2 mL乙醇取代DPPH乙醇溶液的試管作空白實驗。按下式進行DPPH自由基清除率的計算。

DPPH自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A3]×100

式中:A1為樣品實驗的吸光度;A2為空白實驗的吸光度;A3為對照實驗的吸光度。

1.2.7 酶解液對亞鐵離子螯合能力的測定 參照文獻[15]所述方法,向含有2.7 mL蒸餾水和0.1 mL 2 mmol/L FeCl2溶液的試管中,加入2 mL龍須菜蛋白酶解液,然后加入0.2 mL 5 mmol/L的菲洛嗪溶液并振蕩混勻,室溫反應10 min,測定其波長562 nm處吸光度。用蒸餾水替代菲洛嗪溶液作為空白實驗。按下式進行亞鐵離子螯合率的計算。

亞鐵離子螯合率(%)=[1-(A1-A2)/A3]×100

式中:A1為實驗組的吸光度:A2為空白組的吸光度;A3為對照組的吸光度。

1.2.8 還原力的測定 參照文獻[16]所述方法,向試管中依次加入1 mL一定濃度的蛋白酶酶解液,2.5 mL 0.2 mol/L的磷酸緩沖液(pH6.6),2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液,混勻,50 ℃水浴30 min后,加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液。取上清液2.5 mL于比色管中,加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1% FeCl3溶液,室溫放置10 min后,于波長700 nm處測定其吸光度,記為酶解液的還原力。還原能力的強弱與吸光值成正比。

1.3數據處理

響應面實驗設計和數據分析采用Design-Expert 8.0.6軟件。采用Tukey-Kramer post-hoc test對實驗結果進行差異顯著性分析,用Excel 2010軟件對數據進行平均數和標準偏差的統計分析,結果以平均值±標準偏差表示。

2結果與分析

2.1最佳酶種類的選擇

不同蛋白酶對蛋白質水解具有不同的特異酶切位點,可水解肽鏈上不同的部位[17]。由表3可知,復合蛋白酶、木瓜蛋白酶、Alcalase 2.4L、胰蛋白酶、胃蛋白酶5種蛋白酶酶解龍須菜的產物均有一定的亞鐵離子螯合能力和DPPH自由基清除能力,然而,這些蛋白酶酶解液間的抗氧化活性存在顯著差異,這些結果表明了龍須菜蛋白酶解后形成的不同多肽擁有差異顯著的亞鐵離子螯合能力和DPPH自由基清除能力。其中,復合蛋白酶的酶解產物具有最高的亞鐵離子螯合能力和DPPH自由基清除能力,且水解效果最好。同時,復合蛋白酶是針對水解食物蛋白質開發的桿菌蛋白酶復合物,與其他內切蛋白酶相比,具有明顯優勢是其所得的蛋白酶水解液沒有苦味,提高了酶解產物質量[18]。所以選擇復合蛋白酶作為酶解龍須菜蛋白的實驗用酶。

另外,對比木瓜蛋白酶和Alcalase 2.4L蛋白酶的酶解產物,雖然龍須菜在Alcalase 2.4L蛋白酶處理下,其水解度顯著高于木瓜蛋白酶處理的龍須菜,然而在亞鐵離子螯合能力和DPPH自由基清除能力方面,其酶解液低于木瓜蛋白酶處理后的龍須菜酶解液。這些結果表明,酶解液的抗氧化能力與其水解程度沒有顯著相關性。在后續龍須菜蛋白酶解條件優化研究中,亞鐵離子螯合率和DPPH自由基清除率為主要指標,水解度為輔助指標。

2.2單因素實驗

2.2.1 酶解時間的選擇 由圖1可知,隨著蛋白酶酶解時間的延長,在2～8 h范圍內,亞鐵離子螯合能力、DPPH自由基清除能力和水解度不斷增加,并在8 h時,亞鐵離子螯合率為83.88%,DPPH自由基清除率為33.63%,水解度為10.49%,均達到最高值。說明抗氧化能力的提高,與龍須菜酶解后抗氧化多肽的產生有關。此后,隨著酶解時間的延長,酶解液的亞鐵離子螯合率、DPPH自由基清除率開始下降,這可能因為具有抗氧化活性的肽段被進一步水解為更小的肽段和氨基酸等而減弱或失去活性。因此,酶解時間以8 h為宜。

圖1 酶解時間對龍須菜蛋白酶解效果的影響Fig.1 Effect of hydrolysis time on hydrolysis efficiency of Gracilaria lemaneiformis protein

2.2.2 pH的選擇 酶解環境的pH常會影響到酶的穩定性,同時,pH也會影響到底物的解離程度,進而影響酶與底物間的結合而作用于酶解反應[19]。pH對龍須菜蛋白水解度及抗氧化活性的影響如圖2所示。隨著pH的增加,亞鐵離子螯合率、DPPH自由基清除率和水解度開始逐漸增大,當pH為7.0時,亞鐵離子螯合率、DPPH自由基清除率及水解度均達到最大值,分別為72.41%、57.39%和17.01%。此后,隨著pH進一步增加,酶解液的亞鐵離子螯合率、DPPH自由基清除率及水解度均開始下降。因此,酶解pH以7.0為宜。

圖2 pH對龍須菜蛋白酶解效果的影響Fig.2 Effect of pH on hydrolysis efficiency of Gracilaria lemaneiformis protein

2.2.3 酶解溫度的選擇 圖3顯示了溫度對龍須菜酶解反應的影響。在35～50 ℃范圍內,隨著酶解溫度的升高,亞鐵離子螯合率、DPPH自由基清除率和水解度呈現逐漸升高的趨勢,當酶解溫度為50 ℃時,亞鐵離子螯合率、DPPH自由基清除率及水解度均達到最大值,分別為71.12%、45.42%和17.01%。這是由于在酶解過程中,提高溫度可以顯著提高酶解速度,促進龍須菜蛋白水解,從而產生更多的抗氧化多肽。當酶解溫度進一步提高時,亞鐵離子螯合率、DPPH自由基清除率及水解度呈顯著下降趨勢。這是由于溫度過高,蛋白酶變性,從而降低了酶解效率。因此,酶解溫度以50 ℃為宜。

圖3 酶解溫度對龍須菜蛋白酶解效果的影響Fig.3 Effect of temperature on hydrolysis efficiency of Gracilaria lemaneiformis protein

2.2.4 底物質量濃度的選擇 由圖4可知,隨著龍須菜質量濃度的增加,亞鐵離子螯合率、DPPH自由基清除率及水解度呈現先逐漸增大后減小的趨勢,在龍須菜質量濃度為10 g/L時,達到最大值,分別為74.09%、38.41%和15.92%。這是因為隨著龍須菜濃度的增加,接觸幾率增加而提高水解度,同時,水解后產生的多肽含量增加,使亞鐵離子螯合能力和DPPH自由基清除能力得以提高;而龍須菜質量濃度進一步增加時,酶濃度逐漸不足,其催化功能沒有完全發揮,故水解不徹底,進而對酶解液的抗氧化活性產生影響[20]。因此,底物質量濃度以10 g/L為宜。

圖4 底物質量濃度對龍須菜蛋白酶解效果的影響Fig.4 Effect of substrate concentration on hydrolysis efficiency of Gracilaria lemaneiformis protein

2.2.5 加酶量的選擇 加酶量會引起酶反應體系中酶濃度的變化,進而影響龍須菜蛋白的酶解效果,從而影響酶解液的抗氧化活性[21]。由圖5可知,隨著加酶量的增加,亞鐵離子螯合率、DPPH自由基清除率以及水解度呈現先升高后降低的趨勢,在加酶量0.1%時取得最大值,分別為71.43%、39.20%和11.95%。所以加酶量以0.1%為宜。

圖5 加酶量對龍須菜蛋白酶解效果的影響Fig.5 Effect of enzyme dose on hydrolysis efficiency of Gracilaria lemaneiformis protein

2.3響應面實驗

表5 二次回歸方程方差分析Table 5 Analysis of variance of regression equation

根據單因素實驗結果,選取酶解溫度、酶解時間、pH為變量,進行三因素三水平的響應面實驗。復合蛋白酶酶解龍須菜蛋白的工藝條件優化根據Box-Behnken 實驗設計進行了17組實驗,5組為中心點重復實驗(表4)。本實驗把抗氧化活性作為酶解工藝優化的第一指標,水解度作為輔助指標,對DPPH自由基清除能力Y1、亞鐵離子螯合能力Y2與各水解因素進行多元回歸擬合,得二次多項式擬合方程為:Y1=46.73+2.16X1-4.08X2+5.13X3-7.42X1X2-0.30X1X3-4.09X2X3-5.13X12-16.07X22-6.22X32;

Y2=71.56-0.84X1+9.97X2-4.74X3+2.71X1X2-2.97X1X3+1.65X2X3-7.68X12-13.03X22-5.39X32。

表4 Box-Behnken實驗設計及結果Table 4 Box-Behnken experimental design and results

Y1方程回歸模型的決定系數R2=0.9021,p<0.01,說明模型達到極顯著水平,失擬項p=0.0517,影響不顯著,說明該方程擬合良好;Y2方程回歸模型的決定系數R2=0.9141,p<0.01,說明模型達到極顯著水平,失擬項p=0.0530,影響不顯著,說明該方程擬合良好[22]。因此,可以應用Y1和Y2兩個方程描述各響應變量與兩個相應值之間的關系,以評價各因素對相應值影響的顯著性。

由表5可以看出,響應值為DPPH自由基清除率的模型,pH二次項(X22)對響應值影響極顯著,酶解溫度(X3)、酶解時間與pH交互項(X1X2)對響應值影響顯著,各響應因素影響程度依次為:X3>X2>X1,酶解溫度對于酶解液DPPH自由基清除率的影響最大;響應值為亞鐵離子螯合率的模型,pH(X2)、pH二次項(X22)對響應值影響極顯著,酶解溫度(X3)、酶解時間二次項(X12)對響應值影響顯著,各響應因素影響程度依次為:X2>X3>X1,pH對于酶解液亞鐵離子螯合率的影響最大。

通過圖6和圖7即可對任何兩因素交互影響抗氧化活性效應進行分析與評價。響應面為平滑的曲面,且開口向下,說明在響應曲面上存在最大響應值,可從中確定最佳因素水平范圍。結果表明,酶解時間和pH交互作用對DPPH自由基清除效果影響顯著,其他各因素的交互作用不顯著。

2.4最佳制備工藝條件的確定及驗證

圖6 各因素交互作用對DPPH自由基清除能力的影響Fig.6 Response surface plots for the interactive effects of different variables on DPPH radical scavenging activity

圖7 各因素交互作用對亞鐵離子螯合能力的影響Fig.7 Response surface plots for the interactive effects of different variables on ferrous ion-chelating ability

根據Box-Behnken 實驗所得的結果和二次多項式回歸方程,對所建立的數學模型進行工藝參數最優化搜索,獲得了各因素的最佳酶解條件組合為:酶解溫度50.07 ℃、酶解時間8.07 h、pH7.04,此時DPPH自由基清除率為46.36%,亞鐵離子螯合率為72.24%,水解度為17.68%。為了檢驗模型預測的準確性,選取酶解溫度50.1 ℃、酶解時間8.1 h、pH7.0、底物質量濃度10 g/L、加酶量為0.1%做3組平行實驗進行響應面實驗驗證,得到的DPPH自由基清除率達47.66%,亞鐵離子螯合率達74.61%,水解度達17.58%,此結果與最佳理論條件下所得的結果接近。

2.5酶解物與其他抗氧化劑的比較

表6顯示,與酶解前的龍須菜相比,最優條件下龍須菜蛋白酶酶解液擁有更強的DPPH自由基清除能力、亞鐵離子螯合能力和還原力(p<0.05),這說明龍須菜蛋白酶酶解后產生的多肽,提高了整體酶解液的抗氧化活性。這可能是由于龍須菜蛋白結構緊密和水溶性等問題而表現出較弱的抗氧化能力,而蛋白酶水解打破了龍須菜蛋白的天然結構,形成了更多開放、暴露的氨基酸殘基,從而提高了其抗氧化活性。

表6 龍須菜蛋白酶解液與常用抗氧化劑之間的比較Table 6 Comparison of antioxidant activities between protamex-hydrolyte and common antioxidants

抗氧化劑可以通過螯合過渡金屬離子來抑制氧化反應的發生。其中,鐵離子對細胞中ROS的形成起關鍵作用[23],因此本研究選取了亞鐵離子螯合率來評價酶解液的抗氧化活性。結果表明,對比常用天然抗氧化劑0.01%維生素C和合成抗氧化劑0.01%BHA[14],酶解前的龍須菜擁有更好的亞鐵離子螯合能力(p<0.05),此結果與其他藻類類似,這主要與其包含的海藻酸鹽等多糖及酚類物質的存在有關[15]。而最優條件下龍須菜蛋白酶酶解液亞鐵離子螯合能力更強(p<0.05),達到了74.61%,這可能由于蛋白酶解使肽鍵斷裂,自由氨基和羧基濃度的增加隔離了體系內促氧化的金屬離子,從而提高了其抗氧化效果。其次可能是由于某些氨基酸殘基的暴露增加引起的,如組氨酸,它是常見具有金屬螯合能力的氨基酸[14]。通過對龍須菜蛋白質立體結構的酶解,使具有金屬螯合能力的氨基酸殘基更多地暴露于水溶液中,增強了與溶液中亞鐵離子的螯合能力。然而,龍須菜蛋白酶酶解液的亞鐵離子螯合能力隨著蛋白水解度上升,達到峰值后,反而隨蛋白水解度的進一步上升而降低(圖5),這暗示了龍須菜蛋白酶酶解多肽中有適合螯合亞鐵離子的空間結構存在,隨著進一步水解遭到破壞,從而減弱了亞鐵離子螯合能力。近年來鐵元素強化食品的社會需求越來越多,具有亞鐵離子螯合能力的安全有效的抗氧化劑非常受關注,尤其是具有亞鐵離子螯合能力的多肽,因其亞鐵離子螯合物不僅具有營養性強、生物效價高和吸收快等優點,而且具備抗氧化、抗菌等生物活性,同時,相對于氨基酸亞鐵離子螯合物有更好的穩定性和配合率。因此,這種可食用性天然多肽值得進一步的深入研究和開發利用[24]。

而在DPPH自由基清除能力和還原能力方面,最優條件下龍須菜蛋白酶解液顯著強于酶解前的龍須菜(p<0.05),但比0.01%維生素C和0.01%BHA的抗氧化能力弱(p<0.05)。龍須菜蛋白酶酶解液的還原能力提高,主要與蛋白酶酶解暴露出還原性氨基酸殘基有關。而龍須菜蛋白酶酶解液DPPH自由基清除能力的進一步提高,可能與龍須菜蛋白酶酶解產生的小分子多肽有關。現有研究顯示,小分子多肽可在溶液與溶質界面或者固相與氣相界面形成薄膜,從而隔離并保護目標物。如Chang等研究發現,通過蛋白酶解處理,豬血紅蛋白顯著提高了DPPH自由基清除能力[24]。另外,乳清蛋白隨著其水解時間的增加,其DPPH自由基清除能力和抗脂質氧化能力均顯著增加[14],這表明了小分子多肽比大分子蛋白質有更佳的DPPH自由基清除能力。本研究中蛋白酶酶解處理,使龍須菜自由基清除能力的提高與血紅蛋白和乳清蛋白的研究結果非常相似,因此,小分子多肽與蛋白酶酶解提高龍須菜自由基清除能力相關。

3 結論

實驗確定了酶解龍須菜蛋白的最佳用酶為復合蛋白酶。通過單因素實驗和響應面實驗分析,得優化龍須菜蛋白的最佳工藝條件:酶解時間8.1 h、酶解溫度50.1 ℃、pH7.0、底物濃度10 g/L、加酶量0.1%(0.15 AU/g龍須菜粉末),在此條件下酶解龍須菜蛋白,亞鐵離子螯合率達74.61%,DPPH自由基清除率為47.66%,水解度達17.58%。對比常用抗氧化劑,在亞鐵離子螯合能力方面,酶解液顯著高于0.01%維生素C和0.01%BHA(p<0.05),而在DPPH自由基清除能力和還原能力方面,酶解液低于0.01%維生素C和0.01%BHA(p<0.05)。此結果可為今后龍須菜蛋白抗氧化活性肽的分離純化提供有利基礎。

[1]劉朝陽,孫曉慶. 龍須菜的生物學作用及應用前景[J]. 養殖與飼料,2007(5):55-58.

[2]陸崇玉,鄧赟,梅玲,等. 龍須菜化學成分研究[J]. 中草藥,2011,42(6):1069-1071.

[3]周苗,何清,馬曉宇. 東海紅藻龍須菜的營養成分分析及評價[J]. 食品科學,2010,31(9):284-287.

[4]陳洪彬,鄂昱瑾,溫美欽,等. 龍須菜抗氧化肽的制備及其體外抗氧化活性[J]. 泉州師范學院學報,2015,33(2):43-47.

[5]張暉,唐文婷,王立,等. 抗氧化肽的構效關系研究進展[J]. 食品與生物技術學報,2013,32(7):673-679.

[6]阮曉慧,韓軍岐,張潤光,等. 食源性生物活性肽制備工藝、功能特性及應用研究進展[J]. 食品與發酵工業,2016,42(6):248-253.

[7]劉銘,劉玉環,王允圃,等. 制備、純化和鑒定生物活性肽的研究進展及應用[J]. 食品與發酵工業,2016,42(4):244-251.

[8]Sheih I C,Wu T K,Fang T J. Antioxidant properties of a new antioxidative peptide from algae protein waste hydrolysate in different oxidation systems[J]. Bioresource Technology,2009,100：3419-3425.

[9]Ou Y,Qiao Y Y,Wang W Y,et al. Antioxidative peptides prepared fromSpirulinaplatensisand its antioxidative activitiesinvitro[J]. Journal of Food Science and Biotechnology,2014,33:22-26.

[10]杜連啟,楊艷. 海藻食品加工技術[M]. 北京:化學工業出版社,2013:17-26.

[11]于慧,李明艷,張典,等. 響應面實驗優化裙帶菜蛋白酶解工藝及酶解液抗氧化活性[J]. 食品科學,2017,38(6):96-103.

[12]Je J Y,Park P J,Kim E K,et al. Antioxidant activity of enzymatic extracts from the brown seaweedUndariapinnatifidaby electron spin resonance spectroscopy[J]. LWT-Food Science Technology,2009,42:874-878.

[13]周慧江,朱振寶,易建華. 核桃蛋白水解物水解度測定方法比較[J]. 糧食與油脂,2012,25(2):28-30.

[14]彭新顏,孔保華,熊幼翎. 乳清蛋白水解物抗氧化活性的研究[J]. 食品科學,2009,30(3):167-172.

[15]Wang T,Jónsdóttir R,Kristinsson H G,et al. Enzyme-enhanced extraction of antioxidant ingredients from red algae Palmaria palmate[J]. LWT-Food Science Technology,2010,43:1387-1393.

[16]Sampath Kumar N S,Nazeer R A,Jaiganesh R. Purification and identification of antioxidant peptides from the skin protein hydrolysate of two marine fishes,horse mackerel(Magalaspiscordyla)and croaker(Otolithesruber)[J]. Amino Acids,2012,42:1641-1649.

[17]趙春江,孫進,彭莉娟,等. 響應面法優化雞腿菇子實體蛋白酶解工藝條件[J]. 中國食品學報,2013,13(6):88-96.

[18]謝靜,李宗軍. Protamex 復合蛋白酶酶解豬骨粉最佳條件研究[J]. 食品工業科技,2009,30(9):196-198.

[19]李俊江,潘道東,郭宇星,等. 鵝肉蛋白酶解條件優化及酶解產物抗氧化活性研究[J]. 食品科學,2012,33(3):126-130.

[20]常飛,楊雪果,肖士成,等. 脫脂羊腦蛋白酶解條件優化及酶解產物體外抗氧化活性[J]. 食品科學,2015,36(3):114-121.

[21]李俊江,潘道東,郭宇星,等. 鵝肉蛋白酶解條件優化及酶解產物抗氧化活性研究[J].食品科學,2012,33(3):126-130.

[22]馬藝丹,劉紅,馬思聰,等. 神秘果種子多糖的響應面優化提取及其抗氧化活性研究[J]. 食品工業科技,2016,37(10):289-294.

[23]Chang C Y,Wu K C,Chiang S H. Antioxidant properties and protein compositions of porcine haemoglobin hydrolysates[J]. Food Chemistry,2007,100:1537-1543.

[24]劉溫,樓喬明,楊文鴿,等. 多肽金屬元素螯合物研究進展[J]. 食品與發酵工業,2014,40(4):142-146.

OptimizationforenzymatichydrolysisofGracilarialemaneiformisproteinandantioxidantactivityofitshydrolysate

YUHui,LIUHai-mei,LIMeng-na,LINShi-qi,WEIFei-long,GUOHong-yang

(College of Food Engineering,Ludong University,Yantai 264025,China)

Response surface methodology(RSM)was employed to optimize the process conditions for the enzymatic hydrolysis ofGracilarialemaneiformisprotein. After the single enzyme screening experiments,the ferrous ion-chelating and DPPH free radical scavenging abilities as the main index,the degree of hydrolysis as the auxiliary index,the effects of hydrolysis time,pH,hydrolysis temperature,concentration of substrate and enzyme dose on the degree of hydrolysis and the antioxidant activity of hydrolysates were investigated based on the single factor experiments. The results showed that protamex was the best enzyme for the enzymatic hydrolysis ofGracilarialemaneiformisprotein. The optimal conditions for the ferrous ion-chelating ability and the scavenging activity on DPPH free radical were as follows:hydrolysis time of 8.1 h,pH7.0,temperature of 50.1 ℃,substrate concentrate of 10 g/L,and enzyme dose of 0.1%. Under these conditions,the ferrous ion-chelating ability of hydrolysate was up to 74.61%,significantly higher than that of 0.01% ascorbic acid and 0.01% BHA(p<0.05). The scavenging ability of DPPH free radical was 47.66%,and the degree of hydrolysis was 17.58%,lower than that of 0.01% ascorbic acid and 0.01% BHA(p<0.05). These results suggested that the protein hydrolysates possess excellent antioxidant activity.

Gracilarialemaneiformis;enzymatic hydrolysis;response surface methodology;antioxidant activity;hydrolysis degree

2016-12-12

于慧(1982-)，女，博士，講師，研究方向：水產品加工與貯藏，E-mail：zoehuihui@hotmail.com。

教育部留學回國人員科研啟動基金項目(第49批)；魯東大學引進人才項目(LY2013022)。

TS254.9

:A

:1002-0306(2017)12-0157-08

10.13386/j.issn1002-0306.2017.12.029