固定化精氨酸脫亞胺酶的制備與性質研究

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(江南大學食品科學與技術國家重點實驗室,江蘇無錫 214122)

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固定化精氨酸脫亞胺酶的制備與性質研究

蔣航宇,張濤*,江波,沐萬孟,繆銘

(江南大學食品科學與技術國家重點實驗室,江蘇無錫 214122)

從7種大孔型離子交換樹脂中篩選出固定化效果最好的弱堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂D301-G,通過先吸附后交聯的方法對精氨酸脫亞胺酶進行固定化條件及固定化酶性質研究。經單因素實驗,結果表明,最佳固定化條件為每克樹脂加入156 U精氨酸脫亞胺酶液,pH4.0,28 ℃條件下吸附4 h后,在4 ℃冷卻,加入戊二醛溶液至體系內戊二醛體積分數為0.07%,4 ℃下交聯4 h,最優條件下固定化酶活回收率可達85%以上。固定化酶的最適溫度和pH分別為50～60 ℃和5.0～5.5,較游離酶具有更高的溫度穩定性,同時固定化酶的米氏常數Km值比游離酶高。固定化酶在重復使用8次后仍保留57.7%的酶活,表明該固定化酶具有較好的操作穩定性,可為連續生產瓜氨酸提供技術依據。

精氨酸脫亞胺酶,樹脂,固定化,瓜氨酸

瓜氨酸是一種非蛋白質、非必需氨基酸,其主要合成途徑是通過尿素循環在腸道中產生。研究表明,瓜氨酸具有保護DNA[1-2]、維持心血管系統[3-4]、減少運動中內臟的損失[5]、促進肌肉蛋白生成[6]、提高人體性功能[7]等生理功能。因此,瓜氨酸作為一種重要的功能性成分,其市場需求量日益增加。

目前,瓜氨酸生產主要有化學法、提取法、發酵法和酶法四種方法?；瘜W法[8]是在堿性條件下水解精氨酸得到含旋光對映體的瓜氨酸,其產物純化復雜,污染環境。提取法是從植物中分離所得,由于工藝復雜、成本高等原因,其在工業上的應用受到嚴重限制。發酵法[9]是目前生產瓜氨酸的普遍方法,有安全、成本低、反應條件溫和等優點,但由于發酵液成分復雜,產物純化相對困難。因此,最近研究者們開始采用微生物的精氨酸脫亞胺酶法制備瓜氨酸,此法產物濃度高,純化步驟少,產物無DL型對映體結構。然而,酶法應用于工業催化生產受到酶穩定性差、難以回收等缺點的限制。通過酶的固定化技術處理,將酶束縛在一定的空間中,不僅能克服游離酶在應用方面的局限性,還保留酶的催化作用。Kozo等[10]人曾使用聚丙烯酰胺凝膠固定化惡臭假單胞菌細胞生產瓜氨酸,Yang[11]使用殼聚糖固定化糞腸球菌細胞連續生產瓜氨酸,均取得較好的成果。但是,由于細胞內酶系統的復雜性,細胞固定化生產法可能會產生不必要的副產物或將得到的目標產物分解,而固定化酶則沒有這方面的缺點。以樹脂為載體吸附酶分子的方法具有操作簡便、條件溫和、損失較小、成本較低等優點,因此受到不少研究者的推崇。本文使用樹脂作為精氨酸脫亞胺酶的固定化載體,研究酶固定化的條件及固定化酶的酶學性質,為酶法合成瓜氨酸的工業應用提供理論基礎及新思路。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

產酶工程菌株(EscherichiacoliBL21-pET28a-ADI) 由本實驗室構建及保藏;發酵培養基(LB培養基) 10 g/L 胰蛋白胨,5 g/L NaCl,5 g/L酵母提取物;酵母提取物、胰蛋白胨、卡那霉素(kanamycin,Kan)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-1-thiogalactopyr-anoside,IPTG)、L-瓜氨酸、二乙胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)、截留量35 kDa的透析袋 生工生物工程(上海)有限公司;大孔型離子交換樹脂D202-Ⅱ、D301R、D318、D301G、D311 江蘇蘇青集團;大孔型離子交換樹脂DR116、DA201-B 滄州寶恩吸附材料科技有限公司;NaCl、Na2HPO4、NaH2PO4、25%戊二醛溶液、咪唑、三水合乙酸鈉、三乙胺、四氫呋喃、甲醇、乙腈等 中國醫藥集團化學試劑有限公司;L-精氨酸(L-Arg) 純度99%,浙江寧波科瑞生物工程有限公司;Ni2+瓊脂糖凝膠色譜柱 美國通用(瑞典烏普薩拉)電氣醫療集團;蛋白電泳Marker 寶生物工程(大連)有限公司。

SW-CJ-1FD超凈工作臺 蘇凈集團安泰空氣技術有限公司;Centrifuge5804R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司;pH計 梅特勒-托利多儀器有限公司;細胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司;SHA-2冷凍恒溫水浴振蕩器 江蘇太倉實驗設備廠;Agilgent高效液相色譜系統 美國Agilgent公司。

1.2實驗方法

1.2.1 精氨酸脫亞胺酶的制備 挑取已構建完成的產酶菌株E.coliBL21-pET28a-ADI接種至含50 μg/mL Kan的發酵培養基中,37 ℃、轉速200 r/min下培養至發酵液OD600為0.5～0.6,加入終濃度0.8 mmol/L的IPTG,在28 ℃、轉速200 r/min下誘導9 h,8000 r/min離心10 min收集菌體,用磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L,pH5.5)洗滌3次后重懸,冰浴中超聲破碎15 min(功率22 W,破碎1 s,間歇2 s)。在4 ℃下8000 r/min離心15 min后收集上清液,即粗酶液。

采用鎳柱純化蛋白[12]。首先,用緩沖液A(50 mmol/L PBS,500 mmol/L NaCl,pH7.0)對Ni2+螯合瓊脂糖樹脂柱進行預平衡;加入粗酶液后用緩沖液B(50 mmol/L PBS,500 mmol/L NaCl,pH7.0,50 mmol/L咪唑)平衡;最后用緩沖液C(50 mmol/L PBS,500 mmol/L NaCl,pH7.0,500 mmol/L咪唑)將目的酶洗脫后回收?；厥彰敢河煤?0 mmol/L EDTA的磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L PBS,pH5.5)于4 ℃冷室中低溫過夜透析后于4 ℃冰箱儲藏備用。所得酶液蛋白濃度用Lowry法測定[13],并進行SDS-PAGE分析[14]。

1.2.2 樹脂預處理 大孔型離子交換樹脂先用95%乙醇浸泡4 h,用去離子水洗至中性;再用1 mol/L NaOH浸泡4 h,用去離子水洗至中性;最后用1 mol/L HCl浸泡4 h,用去離子水洗至中性,用兩倍以上樹脂體積的去離子水將其浸泡,放置于4 ℃冰箱保存備用。

1.2.3 固定化條件的研究

1.2.3.1 固定化樹脂種類的選擇 取各種處理后的樹脂D202-Ⅱ、D301R、D318、D301G、D311、DR116、DA201-B各加入52 U/g樹脂的酶液,再加入20 mmol/L、pH5.5的磷酸鹽緩沖液至反應體系為1 mL。在28 ℃、200 r/min條件下吸附4 h。冷卻至4 ℃后,加入5 μL、1%戊二醛并混勻,在4 ℃下靜置交聯2 h。去掉上清液,所得固定化酶用磷酸鹽緩沖液洗滌三次后浸泡在20 mmol/L、pH5.5的磷酸鹽緩沖液中,制備完畢后,取一定樣品測定酶活和酶活回收率,剩余樣品置于4 ℃冰箱備用。

1.2.3.2 固定化工藝條件研究 加酶量:以D301-G型樹脂為固定化載體,初始加酶量分別為13、26、52、104、156、208、260 U/g樹脂,再加入20 mmol/L pH5.5的磷酸鹽緩沖液至吸附體系為1 mL。在28 ℃、200 r/min條件下吸附4 h。冷卻至4 ℃后,加入5 μL、1%戊二醛,混勻,在4 ℃下靜置交聯2 h,測定酶活和回收率。

吸附pH:以D301-G型樹脂為固定化載體,初始加酶量為156 U/g樹脂,加入pH分別為3.0～7.5的20 mmol/L的緩沖溶液至吸附體系為1 mL。在28 ℃、200 r/min條件下吸附4 h。冷卻至4 ℃后,加入5 μL、1%戊二醛,混勻,在4 ℃下靜置交聯2 h,測定酶活和回收率。

吸附溫度:以D301-G型樹脂為固定化載體,初始加酶量為156 U/g樹脂,加入pH為4.0的緩沖溶液至吸附體系為1 mL。在分別在溫度4、15、20、28、3、35、40 ℃，200 r/min條件下吸附4 h。冷卻至4 ℃后,加入5 μL、1%戊二醛,混勻,在4 ℃下靜置交聯2 h,測定酶活和回收率。

吸附時間:以D301-G型樹脂為固定化載體,初始加酶量為156 U/g樹脂,加入pH為4.0的緩沖溶液至吸附體系為1 mL。在28 ℃、200 r/min條件下分別吸附0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 h。冷卻至4 ℃后,加入5 μL、1%戊二醛,混勻,在4 ℃下靜置交聯2 h,測定酶活和回收率。

戊二醛濃度:以D301-G型樹脂為固定化載體,初始加酶量為156 U/g樹脂,加入pH為4.0的緩沖溶液至吸附體系為1 mL。在28 ℃、200 r/min條件下吸附4 h。冷卻至4 ℃后,分別加入0、1、3、5、7、10、20、30、40 μL、1%戊二醛(即交聯體系戊二醛濃度為0.0、0.01%、0.03%、0.05%、0.07%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%),混勻,在4 ℃下靜置交聯2 h,測定酶活和回收率。

交聯時間:以D301-G型樹脂為固定化載體,初始加酶量為156 U/g樹脂,加入pH為4.0的緩沖溶液至吸附體系為1 mL。在28 ℃、200 r/min條件下吸附4 h。冷卻至4 ℃后,加入7 μL、1%戊二醛,混勻,在4 ℃下靜置分別交聯0、1、2、3、4、5、6、7、8 h,測定酶活和回收率。

1.2.4 精氨酸脫亞胺酶酶活的測定 游離酶活力測定:取500 μL 100 g/L L-精氨酸溶液和400 μL 20 mmol/L pH5.5的磷酸鹽緩沖液于試管中,加入100 μL酶液,充分混勻,45 ℃水浴下反應10 min,迅速煮沸10 min終止反應,10000 r/min離心10 min后,測定上清液瓜氨酸含量。

固定化酶活測定:取0.5 g固定化酶,加入500 μL 100 g/L L-精氨酸溶液和500 μL 20 mmol/L pH5.5的磷酸鹽緩沖液,混勻,在45 ℃條件下反應10 min后,迅速煮沸10 min終止反應后,取上清液,10000 r/min離心10 min后,測定上清液瓜氨酸含量。

酶活定義:1 min時間內產生1 μmol L-瓜氨酸所需的酶量為一個酶活力單位(1 U)。

酶活回收率(%)=(固定化酶酶活/用于固定化的總酶活)×100

1.2.5 瓜氨酸檢測方法 HPLC條件[15]:Angilent 1200;色譜柱:Hypersil ODS(5 μm,4.0 mm×250 mm);流動相A:水2 L,三水合乙酸鈉13 g,三乙胺0.4 mL,四氫呋喃5 mL,pH7.2±0.5;流動相B:2 L,三水合乙酸鈉15 g,水/甲醇/乙腈(體積比1∶2∶2),pH7.2±0.5;流動相A與流動相B梯度洗脫,A/B相流量比在0、20、24、25.5和28.5 min時分別為92∶8、62∶38、0∶100、0∶100和92∶8?？偭魉?1.0 mL/min;柱溫:40 ℃;進樣量:10 μL;檢測器:紫外檢測器;檢測波長:338 nm,發射波長262 nm。

標準曲線的繪制：配制0.2 g/L L-瓜氨酸溶液，分別取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL加入試管并用去離子水補充至2 mL。取400 μL溶液至液相小瓶，根據上述條件進行HPLC檢測，以瓜氨酸濃度為橫坐標x，峰面積為縱坐標y，繪制得到標準曲線方程y=135875x+33.259，R2=0.9956。

1.2.6 固定化精氨酸脫亞胺酶性質的研究

1.2.6.1 溫度對酶活及穩定性的影響 最適反應溫度的確定:將固定化酶及游離酶反應體系分別置于40～65 ℃中,按照1.2.4節實驗方法進行酶反應。將最適反應溫度下樣品的酶活力定義為100%。熱穩定性的研究:將固定化酶及游離酶分別在20～50 ℃中預保溫30 min后,按照1.2.4節實驗方法進行酶反應,測其殘余酶活。將保溫0 min的樣品的酶活力定義為100%。

殘余酶活(%)=(經保溫處理后的酶活/處理前的酶活)×100

1.2.6.2 pH對酶活及穩定性的影響 最適pH的確定:將預保存在pH4.0～7.5緩沖液的固定化酶及游離酶按照1.2.4節實驗方法進行酶反應。將最適反應pH下樣品的酶活力定義為100%。pH穩定性的研究:將相同濃度的固定化酶及游離酶分別在pH為4.0～7.5的緩沖液中于4 ℃預保存12 h,將pH調至5.5后按照1.2.4節實驗方法進行酶反應,測其殘余酶活。將最穩定pH下的樣品的酶活力定義為100%。

殘余酶活(%)=(在不同pH處理后的酶活/處理前的酶活)×100

1.2.6.3 固定化對米氏常數的影響 分別配制4、6、8、10、20、30 mmol/L濃度的L-精氨酸溶液,加入游離酶和固定化酶,按照1.2.4節實驗方法,測定游離酶和固定化酶酶活,繪制雙倒數曲線1/V-1/S,V表示酶的反應速度,S表示底物濃度。通過計算獲得游離酶和固定化酶的雙倒數方程,根據雙倒數方程求得Km值。

1.2.6.4 固定化酶操作穩定性的研究 在最優條件下對酶進行固定化,取一定量的固定化酶,取0.5 g固定化酶,加入500 μL 100 g/L L-精氨酸溶液和500 μL 20 mmol/L pH5.0的磷酸鹽緩沖液,混勻,在55 ℃條件下反應10 min后,立即吸取上清液煮沸終止反應,用緩沖溶液洗滌固定化酶三次后重復上述操作,連續進行8次。將第一次測得的固定化酶活力定義為100%。

1.3數據處理

實驗中每個數據處理重復三次,應用Origin 9.0和Excel軟件作圖。

2 結果與分析

2.1精氨酸脫亞胺酶的制備

通過SDS-PAGE電泳鑒定,經Ni2+螯合瓊脂糖樹脂柱后酶液呈現單一的蛋白條帶,達到電泳純,分子量約為54.1 kDa(圖1)。通過Lowry法測定純化后的酶液的蛋白含量,結果顯示純酶液蛋白濃度為2.64 mg/mL,純酶液的酶活力為345.84 U/mL,可用于做固定化酶的研究。

圖1 精氨酸脫亞胺酶電泳圖譜Fig.1 Electrophoresis map of the arginine deiminase注:1.Marker;2.粗酶液;3. Ni2+螯合瓊脂糖樹脂柱后酶液。

2.2精氨酸脫亞胺酶固定化條件的優化

2.2.1 固定化樹脂種類 吸附分為多個連續復雜的步驟,其過程中同時存在吸附和解吸過程,吸附樹脂的顆?？讖?、極性,以及吸附樹脂表明的功能基團的性質,即極性、酸堿性、氫鍵成鍵能力等都會對吸附選擇性和吸附行為產生影響[16]。由表1結果可知,在相同條件下,樹脂種類對吸附效果的影響較大。7種大孔型離子交換樹脂均對精氨酸脫亞胺酶有一定的吸附作用,其中大孔弱堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂D301G的回收率最高,其化學穩定性好、表面積和吸附量相對較大,抗污能力強。其中樹脂D202-Ⅱ、DA201-B和DR116固定化效果較差,可能是由于D202-Ⅱ和DA201-B是強堿性而DR116為弱酸性,不利于精氨酸脫亞胺酶分子與載體的結合,甚至可能使酶結構發生改變而影響其催化活性。樹脂D311和D318的固定化效果也不理想,可能是由于其骨架結構為丙烯酸系,與苯乙烯系樹脂相比與精氨酸脫亞胺酶分子的親和性較低。雖然樹脂D301R與D301G的分類及骨架型號相同,但由于生產廠家和生產方式的不同其特性不盡相同,結果表明,樹脂D301G對精氨酸脫亞胺酶的吸附性更強。因此,選擇D301G樹脂作為固定化載體材料最佳。

表1 不同樹脂的固定化效果Table 1 Effect of various resins on immobilization

2.2.2 加酶量 在不同加酶量下酶活及酶活回收率如圖2所示,固定化酶酶活隨加酶量的升高而增加,而酶活回收率在加酶量低于156 U/g樹脂時隨加酶量增加而增加,在加酶量高于156 U/g樹脂時隨加酶量增加而逐漸減少。這是由于載體的活性基團的量是一定的,隨著加酶量的增加樹脂吸附能力逐漸趨于飽和,在酶分子與樹脂的結合達到飽和之后當載體的酶負載量增加,反而會發生分子相互重疊,空間位阻加大,酶分子的空間可塑性被限制[17],因此雖然酶活一直逐漸增加,但當載體所吸附的酶趨于飽和后酶的回收率開始降低。因此,選擇156 U/g樹脂為最佳初始加酶量。

圖2 加酶量對酶固定化的影響Fig.2 Effects of volume of enzyme on enzyme immobilization

2.2.3 pH 研究不同吸附pH下固定化酶活的吸附情況,結果如圖3所示,在吸附pH為4.0時固定化酶活最高。當pH小于4.0時酶活隨pH的增加而增加,pH大于4.0后,相對酶活隨著pH的增加而逐漸降低。因為pH能對精氨酸脫亞胺酶分子上的巰基或酚羥基的酸堿分布有影響[18],pH的過高或過低都會影響酶與載體的共價連接及酶的空間構象,以及酶分子與載體的親和吸附力,由此造成酶活力的改變。結果可知pH為4.0時固定化酶的吸附效果最佳。

圖3 pH對酶固定化的影響Fig.3 Effects of pH on enzyme immobilization

2.2.4 溫度 不同吸附溫度對吸附效果的影響如圖4所示,在28 ℃條件下,固定化酶活最高。在4 ℃到28 ℃時,固定化酶活隨吸附溫度的升高而增加,這是由于酶蛋白吸附樹脂是一個吸熱過程,溫度較低,樹脂對酶的吸附較困難,隨著溫度的升高,樹脂和酶分子獲得更多的能量,吸附量也相應提高。當溫度超過最適溫度28 ℃時,溫度升高可能引起酶結構的變化,同時分子運動的加劇一方面使酶分子吸附到樹脂上,另一方面也容易從樹脂上脫落。同時溫度過高會對酶分子的空間結構產生破壞[19]。因此,最佳吸附溫度為28 ℃。

圖4 溫度對酶固定化的影響Fig.4 Effects of temperature on enzyme immobilization

2.2.5 吸附時間 選擇吸附時間為0～10 h分別進行固定化,其他固定化條件不變。結果如圖5所示,當吸附時間小于4 h時,酶活隨時間的增加而增加;在吸附4 h時酶活達到最高117.14 U/g樹脂;吸附4 h后,酶活隨時間的增加而逐漸減少?？赡苁怯捎诠潭ɑ跗?載體的載酶量隨著時間的增加而增加,同時載體對酶分子的吸附能力也逐漸減弱。因此隨著吸附能力逐漸喪失,受到反應介質的影響,部分已固定的酶分子也逐漸失活、脫落,導致固定化酶活降低[20]。結果表明,吸附時間為4 h時固定化效果最好。

圖5 吸附時間對酶固定化的影響Fig.5 Effect of adsorption time on enzyme immobilization

2.2.6 戊二醛濃度 在戊二醛濃度為0～0.4%的體系下分別進行交聯,結果如圖6所示,當戊二醛濃度低于體積分數0.07%時,酶活隨著濃度的增加而增加,當戊二醛濃度為體積分數0.07%時,酶活達到最高;當戊二醛濃度大于體積分數0.1%時,酶活隨著濃度的增加而逐漸降低。戊二醛是使載體的氨基與酶分子的氨基形成席夫堿而實現酶與載體的共價結合。戊二醛既是固定化的交聯劑也是一種酶的變性劑,因此戊二醛濃度較低時有利于酶與載體的交聯,但當戊二醛用量過高時,可能造成酶分子之間的交聯重疊,而使酶分子構象發生改變,造成已固定在載體上的酶失活[21],因此戊二醛用量的選擇尤為重要。結果表明,戊二醛濃度為體積分數0.07%時效果最佳。

圖6 戊二醛濃度對酶固定化的影響Fig.6 Effect of glutaraldehyde volume concentration on enzyme immobilization

2.2.7 戊二醛交聯時間 選取不同交聯時間0～8 h分別進行交聯,如圖7所示,當交聯時間小于4 h時,酶活隨著時間的增加而增加,在4 h時達到最大值后,酶活隨時間的增加而逐漸減少。戊二醛交聯初期,在溫度較低且靜置環境下,酶活逐漸增加;酶與樹脂交聯達到飽和后,在戊二醛的繼續作用下,酶分子開始自聯或逐漸變性[22],酶活逐漸降低。由此可知,戊二醛交聯4 h為最適交聯時間。

圖7 戊二醛交聯時間對酶固定化的影響Fig.7 Effect of crosslinking time on enzyme immobilization

2.3 固定化精氨酸脫亞胺酶酶學性質的研究

2.3.1 溫度對固定化酶酶活及穩定性的影響 圖8可知,游離酶和固定化的最適溫度基本相同,在50～60 ℃范圍內。由圖9可知,固定化酶與游離酶相比具有更優的溫度穩定性,在保溫溫度低于30 ℃時它們的溫度穩定性結果基本一致,而當保溫溫度大于30 ℃時,固定化酶的溫度穩定性明顯優于游離酶。在酶與載體結合后分子熱穩定性提高,可能是由于酶分子與載體結合后剛性增強,不易折疊變形,使固定化酶對溫度改變的敏感度降低[19]。

圖8 溫度對精氨酸脫亞胺酶活性的影響Fig.8 Effects of temperature on activity of arginine deiminase

圖9 溫度對精氨酸脫亞胺酶穩定性的影響Fig.9 Effect of immobilization on thermostability of arginine deiminase

圖10 pH對精氨酸脫亞胺酶活性的影響Fig.10 Effect of pH on activity of arginine deiminase

2.3.2 pH對固定化酶酶活及穩定性的影響 由圖10可以看出固定化酶的最適pH比游離酶低,由5.5～6.0變為5.0～5.5，這是由于載體D301G內的H+質子存在著擴散阻滯作用,以及D301G樹脂是一種弱堿性載體,這樣的微環境與本體溶液之間的質子形成濃度差,使精氨酸脫亞胺酶的最適pH和穩定pH向酸性方向移動[17]。由圖11可知,由于載體與酶分子作用,固定化酶的pH穩定性也向酸性方向移動。同時,在偏離最適pH后穩定性較游離酶提高,在pH7.5時仍保留60%以上的酶活。由此可以看出,固定化酶最穩定pH向酸性方向偏移,而穩定性優于游離酶。

2.3.3 酶反應動力學研究 由圖12計算得固定酶的米氏常數Km為11.79 mmol/L,較游離酶的米氏常數Km(10.95 mmol/L)高。這表示固定化酶的底物親和力較游離酶低,這是由于固定化的過程中酶分子的空間構象發生變化[19],同時由于載體一定的阻隔作用,使酶與底物接觸時的空間障礙或擴散位阻增加,一定上影響兩者之間的親和力,使固定化酶Km提高。

圖12 游離酶與固定化酶酶促反應動力學Fig.12 Kinetic paramerters of free arginine deiminase and immobilized enzyme

2.4固定化酶的操作穩定性

圖13 固定化酶操作穩定性Fig.13 The operational stability of immobilized enzyme

在最優固定化條件下對精氨酸脫亞胺酶進行固定化,并在最適反應溫度和pH下測得固定化酶的酶活為132.7 U/g樹脂,85.11%的酶活回收率。固定化酶的操作穩定性如圖13所示,固定化酶的相對酶活隨著反應次數的增加而逐漸降低,但在使用8次后仍保留57.7%的酶活。由于部分酶與載體連接不夠緊密[23],固定在載體上的酶脫落,固定化酶在幾次使用后酶活力下降,也可能是底物與酶分子的反復結合后活性部位的變形[24],導致酶催化效率的降低。結果表明固定化精氨酸脫亞胺酶相對于只能使用一次的游離酶而言,使用效率提高,并具有較好的操作穩定性。

3 結論

本實驗優化了采用大孔型離子交換樹脂固定精氨酸脫亞胺酶的條件,在最優條件下,固定化酶活力為132.7 U/g樹脂,酶活回收率達85.11%。通過研究固定化酶的酶學性質發現,固定化酶的最適反應溫度與游離酶相近均為55 ℃左右,而溫度穩定性在35～50 ℃下高于游離酶;固定化酶的最適pH和最穩定pH較游離酶向酸性方向偏移,最適pH由5.5～6.0變為5.0～5.5,而在pH4.5～5.0時固定化酶的穩定性高于游離酶;固定化酶的米氏常數為11.79 mmol/L,較游離酶的親和力有所降低。在重復操作8次之后固定化酶仍保留57.7%的酶活。精氨酸脫亞胺酶的樹脂固定化具有成本低,操作簡單,制備條件溫和,可有效提高酶的穩定性及使用效率等優點,適合用于工業化生產瓜氨酸。

[1]Akashi K,Miyake C,Yokota A. Citrulline,a novel compatible solute in drought-tolerant wild watermelon leaves,is an efficient hydroxyl radical scavenger[J]. Febs Letters,2001,508:438-442.

[2]Luke A,Esposito S M,Alexander Panov,et al. Wallace Mitochondrial disease in mouse results in increased oxidative stress[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1999,96:4820-4825.

[3]Chernyavskaya O G,hishkanova N V,Il’Chenko A P,et al. Synthesis ofα-ketoglutaric acid by Yarrowia lipolytica yeast grown on ethanol[J]. Applied Microbiology & Biotechnology,2000,53:152-158.

[4]Wiesinger H. Arginine metabolism and the synthesis of nitric oxide in the nervous system[J]. Progress in Neurobiology,2001,64:365-391.

[5]Kim V W,Wijnands K A P,Meesters D M,et al. L-Citrulline Improves Splanchnic Perfusion and Reduces Gut Injury during Exercise[J]. Medicine & Science in Sports & Exercise,2014,46:2039-2046.

[6]Jourdan M,Nair K S,Carter R E,et al. Citrulline stimulates muscle protein synthesis in the post-absorptive state in healthy people fed a low-protein diet - A pilot study[J]. Clinical Nutrition,2014,34:449-456.

[7]Khatun M M,Hossain M S,Khalekuzzaman M,et al.Invitroplant regeneration from cotyledon and internodes derived callus in watermelon(CitruluslanatusThumb.)[J]. Int J Sustain Crop Prod,2010,5(4):25-29.

[8]Plimmer R H A. The Analysis of Proteins The Estimation of Arginine by Decomposition with Alkali[J]. Biochemical Journal,1916,10:115-119.

[9]Okumura S,Shibuya M,Konishi S,et al. The Fermentative Production of L-Citrulline[J]. Agricultural & BiologicalChemistry,1964,28:742-743.

[10]Kozo Y,Tadashi S,Tetsuya T,et al. Continuous production of L-citrulline by immobilized Pseudomonas putida cells[J]. Biotechnology & Bioengineering,1974,16:1589-1599.

[11]Yang Z. Immobilization of Enterococcus faecalis cells with chitosan-A new process for the industrial production of l-citrulline[J]. Process Biochemistry,2015,50:1056-1060.

[12]Laurie E,Rebecca G,Tonny J. Methods and kits for purifying his-tagged proteins-WO 2005035092 A1[P]. 2005.

[13]Lowry O H,Rosebrough N J,Farr A L,et al.Protein measurement with the Folin phenol reagent[J]. Journal of Biological Chemistry,1951,193:265-275.

[14]Yuen S W,Chui A H,Wilson K J,et al. Microanalysis of SDS-PAGE electroblotted proteins[J]. Bio Techniques,1989,7:74-83.

[15]牟昳,袁其朋,翁南梅,等.高效液相色譜分析L-瓜氨酸的研究[J]. 北京化工大學學報(自然科學版),2004,31:110-112.

[16]婁嵩,劉永峰,白清清.邸多隆大孔吸附樹脂的吸附機理[J].化學進展,2012,24:1427-1436.

[17]孔維,周慧,劉輝,等.固定化葡萄糖異構酶最適pH的調節[J].中國生物化學與分子生物學報,1992:212-215.

[18]Liu J F,Liu H,Tan B,et al. Reversible immobilization of K. fragilisβ-galactosidase onto magnetic polyethylenimine-grafted nanospheres for synthesis of galacto-oligosaccharide[J]. Journal of Molecular Catalysis B Enzymatic,2012,82:64-70.

[19]范欽華,周小凡.固定化植物酯酶的制備及應用[J].現代化工,2015,35(3):112-115.

[20]曾家豫,趙蔓,楊紅,等.改性離子交換樹脂固定化漆酶及其動力學性質研究[J]. 西北師范大學學報：自然科學版,2004,50:86-91.

[21]陳輝,張劍波,王維敬,等.殼聚糖固定化云芝漆酶的制備及特性[J].北京大學學報(自然科學版),2006,42:254-258.

[22]李秋喜,林春芳,沐萬孟,等. 海藻酸鈉固定細胞產D-阿洛酮糖的研究[J].食品工業科技,2015(7):172-176.

[23]王冕,王如福,張茜.固定化酸性蛋白酶載體的選擇及其性質[J].食品科學,2015,36:89-94.

[24]張汝壯,周彥波,朱明英,等. 離子交換樹脂固定接枝脂肪酶[C].全國博士生學術年會,2012,31(5-6):54-57.

Preparationandcharacterizationofimmobilizedargininedeiminase

JIANGHang-yu,ZHANGTao*,JIANGBo,MUWan-meng,MIAOMing

(State Key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

Arginine deiminase(ADI)was immobilized on 7 kinds of ion-exchange resins,in which D301-G was the best material for the immobilization. And the enzyme was immobilized by cross-linkage of glutaraldehyde. After single-factor experiments,the optimal immobilized conditions were enzyme load of 156 U/g resin,4-hour absorption at 28 ℃,pH4.0,the glutaraldehyde concentration of 0.07% and 4-hour cross-linking action at 4 ℃. Besides,the activity recovery yield of the immobilized enzyme reached above 85%.The optimal temperature and pH of the immobilized enzyme was 50～60 ℃ and 5.0～5.5,respectively,and it presented higher thermostability and higher Kmthan that of the free enzyme. The immobilized enzyme retained 57.7% of its initial enzyme activity after reuse for eight times. The results showed the enzyme immobilized which provided a technical basis for the application of arginine deminase industrially continuously producing citrulline.

arginine deiminase;resin;immobilization;citrulline

2016-12-14

蔣航宇(1992-)，女，碩士研究生，研究方向：食品生物技術，E-mail：jhy921fendou@163.com。

*通訊作者:張濤(1973-)，女，博士，教授，研究方向：食品功能配料的研究與開發，E-mail：zhangtao@jiangnan.edu.cn。

十二五863計劃糖質資源高效生物利用關鍵技術研究(2013AA102102)。

TS201.2+5

:A

:1002-0306(2017)12-0129-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.12.024