異綠原酸A的抗氧化活性研究

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(1.山西醫科大學藥學院,山西太原 030001; 2.山東省科學院生物研究所,山東省科學院重點實驗室, 山東省生物檢測技術工程實驗室,山東濟南 250014; 3.山東省生物傳感器重點實驗室,山東濟南 250014; 4.山東省分析測試中心,山東濟南 250014;)

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異綠原酸A的抗氧化活性研究

侯彩平1,2,韓利文2,3,張鳳1,2,楚杰2,3,張軒銘2,3,王榮春2,3,陳錫強2,3,王岱杰4,劉可春2,3,田青平1,*,何秋霞2,3,*

(1.山西醫科大學藥學院,山西太原 030001; 2.山東省科學院生物研究所,山東省科學院重點實驗室, 山東省生物檢測技術工程實驗室,山東濟南 250014; 3.山東省生物傳感器重點實驗室,山東濟南 250014; 4.山東省分析測試中心,山東濟南 250014;)

從忍冬根藥材中提取異綠原酸A,采用DPPH法、水楊酸比色法、鄰苯三酚自氧化法及還原力測定法來進行體外抗氧化實驗,利用皮膚熒光斑馬魚模型研究異綠原酸的體內抗氧化活性。結果表明,在0.5～10 μg/mL范圍內,異綠原酸A對DPPH和羥基自由基表現出了較好的清除作用,清除率最高分別達97.04%和60.01%;而異綠原酸A在5～200 μg/mL范圍內超氧自由基清除率最高僅達到28.04%;還原力測定OD值在0.5～100 μg/mL范圍內最高達0.98,說明異綠原酸A的還原能力強;異綠原酸A在皮膚熒光斑馬魚體內抗氧化效果良好,在濃度為25 μg/mL時,相對抗氧化能力可達到60.4%。異綠原酸A對自由基有較好的清除能力,有良好的體內體外抗氧化活性。

異綠原酸A,皮膚熒光斑馬魚,抗氧化能力,自由基

異綠原酸是綠原酸的二咖啡酰基取代異構體,該類化合物是由奎寧酸與咖啡酸通過酯化反應縮合而成的有機酚酸類天然產物,廣泛存在于金銀花(Lonicerajaponica)、杜仲以及含酚酸類物質的植物中[1],異綠原酸有抗炎、抗病毒、降血壓和體外抗氧化活性[2]。異綠原酸A(3,5-O-二咖啡酰奎寧酸)和異綠原酸C呈現較好的抗炎活性,能通過抑制白細胞遷移和炎癥過程超氧陰離子的產生而發揮體外抗炎作用[3]。在異綠原酸A對大腸桿菌抑菌實驗時,周志娥等[4]發現其抑菌效果好于綠原酸,對細胞膜、細胞壁的作用效果也強于綠原酸。Robinson等[5]發現異綠原酸A除了能抑制HIV-1整合酶,還能抑制HIV-1在組織中的復制,對HIV-1的治療指數大于100。Oh等[6]研究了異綠原酸A和C的降血壓作用,均能抑制血管緊張素轉換酶的活性。Iwai等[7]對綠咖啡豆中的7種異綠原酸類化合物體外抗氧化活性進行了測試,其中異綠原酸A、B、C均有抗氧化活性。Heilmann等[8]利用人中性白細胞以酵母多糖刺激產生呼吸爆發,檢測細胞氧自由基的生成情況,表明異綠原酸A有很強的捕獲超氧陰離子和羥基自由基的能力。

異綠原酸A的研究主要集中于制備工藝、含量測定、藥理活性[1]及體外抗氧化活性方面的研究[9],其體內抗氧化活性研究較少,本文采用皮膚熒光斑馬魚模型來評價異綠原酸A體內抗氧化效果。斑馬魚的基因與人類基因有87%的相似性,被廣泛地應用于生命科學研究[10]。轉基因皮膚熒光斑馬魚cy17(krt4-NTR:GFP)(簡稱皮膚熒光斑馬魚)是將綠色熒光蛋白連接在角質細胞上[11],該品系內置硝基還原酶元件,加入甲硝唑能夠導致角質細胞產生凋亡且綠色熒光蛋白表達降低。而加入抗氧化物質會抑制角質細胞的凋亡,綠色熒光蛋白表達也相應增加,故通過在熒光顯微鏡下觀察并計數角質細胞變化,來測定物質的抗氧化能力[12]。通過體內外實驗考察異綠原酸A的抗氧化活性,對將其研制成有抗氧化活性的天然藥物提供一些參考。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

實驗用忍冬根 濟南市建聯中藥店,經鑒定該藥材為忍冬科、忍冬屬、忍冬(LonicerajaponicaThunb)的干燥根;間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽(MS222) Sigma公司,CAS:886-86-2;水 雙蒸水;斑馬魚培養水 配方為5 mmol/L NaCl,0.17 mmol/L KCl,0.14 mmol/L CaCl2,0.16 mmol/L MgSO4;VC國藥集團化學試劑有限公司;甲硝唑(培養水溶解,現配現用) 北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 上海梯希愛化成發展有限公司;薄層硅膠GF254、柱色譜硅膠(200～300目) 青島海洋化工廠;HPLC用甲醇、乙腈為色譜純 美國Tedia公司;轉基因皮膚熒光斑馬魚cy17(krt4-NTR:GFP) 山東省科學院生物研究所繁殖;HPLC用水 純凈水;無水乙醇、乙酸乙酯、甲醇、石油醚、VC、二甲基亞砜(DMSO)、KCl、CaCl2、MgSO4、亞硝酸鈉、硝酸鋁、硫酸亞鐵、水楊酸、雙氧水、二氯甲烷、氯化鐵、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、氫氧化鈉等試劑 分析純。

YMC-PEAK ODS-A column(250 mm×4.6 mm,i.d. 5 μm)分析型色譜柱 安捷倫科技有限公司;旋轉蒸發器R-3 瑞士BUCHI公司;普源L-3000系列高效液相色譜儀 北京普源精電科技有限公司;Waters 600型高效液相色譜儀 美國Waters公司;Bruker-400核磁共振波譜儀 瑞士布魯克公司;Agilent 1200RRLC-6410 QQQ-MS/MS質譜儀 安捷倫科技有限公司;Nicolet710傅里葉變換紅外光譜儀 上海力晶科學儀器有限公司;SPECTRA MR多功能酶標儀 北京宏昌信科技有限公司;Olympus SZX-16型熒光顯微鏡 日本Olympus公司;LE 204E/02型電子天平 上海梅特勒-托利多儀器有限公司;恒溫培養箱 上海精宏實驗設備有限公司;KQ2200DV型數控超聲波沖洗器 昆山市超聲儀器有限公司;電熱恒溫水浴鍋 上海賀德實驗設備有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 從忍冬根中提取異綠原酸A 稱取干燥忍冬根5 kg,粉碎,95%乙醇分別回流提取2、2和1 h,提取液合并、濃縮,得乙醇提取物;依次用等體積石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取4次,分別合并每部分萃取液,減壓濃縮干燥得到3種浸膏。其中乙酸乙酯浸膏通過硅膠柱色譜(CH2Cl2-CH3OH,100∶0→0∶100)分為13段。第9部分(CH2Cl2-CH3OH,10∶1)經硅膠柱色譜、Sephadex LH-20、高效制備液相色譜得七種化合物[13],測定其氫譜和碳譜。

1.2.2 異綠原酸A體外抗氧化實驗

1.2.2.1 DPPH自由基清除實驗 采用DPPH法[14]測定異綠原酸A對DPPH自由基的清除作用。將異綠原酸A用DMSO配制成2 mg/mL的母液,再分別用水依次稀釋為10、5、2.5、1、0.5 μg/mL的實驗濃度。0.1 mmol/L DPPH溶液用無水乙醇配制,錫箔紙包裹避光備用。準確吸取200 μL不同濃度的異綠原酸A溶液和300 μL新配制的0.1 mmol/L DPPH溶液到EP管中,混合均勻,錫箔紙包裹后于室溫暗反應30 min,以VC溶液作為陽性對照,在517 nm處用酶標儀測定反應液的吸光度。樣品對DPPH清除率的計算公式為:

SA(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100

其中,Ai為樣品溶液的吸光度,Aj為抗氧化劑本底吸光度,A0為空白對照吸光度。

1.2.2.2 羥基自由基清除實驗 采用水楊酸比色法[15]測定異綠原酸A對羥基自由基的清除作用。將異綠原酸A用DMSO配制成2 mg/mL的母液,再分別用水依次稀釋為10、5、2.5、1、0.5 μg/mL的實驗濃度。在EP管中依次加入100 μL FeSO4溶液,100 μL不同濃度抗氧化劑溶液,100 μL水楊酸乙醇溶液,混合均勻,最后加入100 μL 6 mmol/L H2O2溶液,反應開始,置37 ℃水浴反應30 min,用酶標儀于510 nm處測得吸光度Ai;用水代替反應體系中的H2O2測得抗氧化劑本底吸光度Aj;用水代替反應體系中的抗氧化劑測得空白對照吸光度A0。羥基清除率計算公式如下:

SA(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100。

1.2.2.3 超氧自由基清除實驗 采用鄰苯三酚自氧化法[16]測定異綠原酸A對超氧自由基的清除作用。將異綠原酸A用DMSO配制成2 mg/mL的母液,再分別用水依次稀釋為200、50、20、10、5 μg/mL的實驗濃度。取450 μL 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液和100 μL的異綠原酸A溶液到EP管中,混合均勻,25 ℃水浴20 min后,加入40 μL 25 ℃預熱的鄰苯三酚溶液,混勻,置于25 ℃水浴4 min后,立刻加入100 μL 8 mmol/L的鹽酸溶液。用酶標儀測定320 nm波長處的吸光度值,以VC溶液作為陽性對照。超氧自由基清除率計算公式如下:

SA(%)=(A0-Ax)/A0×100

式中,A0為不加抗氧化劑的空白對照吸光度,Ax為抗氧化劑吸光度。

1.2.2.4 還原力實驗 采用還原力測定法[17]測定異綠原酸A的還原能力。將異綠原酸用DMSO配制成2 mg/mL的母液,再分別用水依次稀釋為100、50、10、1、0.5 μg/mL。稱取Na2HPO47.16 g以適量水溶解后再定容至100 mL配制成0.2 mol/L的甲溶液,稱取NaH2PO43.12 g以適量水溶解后再定容至100 mL配制成0.2 mol/L的乙溶液,各取甲溶液40 mL,乙溶液60 mL混合配制成磷酸緩沖液。稱取鐵氰化鉀1 g以適量水溶解后再定容至100 mL配制成1%濃度的鐵氰化鉀溶液。稱取二氯乙酸10 g以適量水溶解后再定容至100 mL配制成10%濃度的二氯乙酸溶液。稱取FeCl30.1 g以適量水溶解后再定容至100 mL配制成0.1%濃度的FeCl3溶液。用移液槍準確取400 μL不同濃度的異綠原酸A和VC溶液加入到2 mL EP管中,然后加入400 μL 0.2 mol/L的磷酸緩沖液,再添加400 μL 1%的鐵氰化鉀溶液后混勻。置于50 ℃的水浴鍋中反應20 min。反應結束后加入400 μL 10%的二氯乙酸溶液混勻后,在離心機中以3000 r/min的轉速離心10 min,吸取上清液800 μL加入已配好的FeCl3溶液(80 μL 0.1%的FeCl3溶液和640 μL蒸餾水)中混勻。靜置10 min,用酶標儀于700 nm處測定吸光度。

1.2.3 皮膚熒光斑馬魚體內抗氧化活性研究 皮膚熒光斑馬魚的養殖方法參照Westerfield[18]的方法,選擇成熟的皮膚熒光斑馬魚,按照雌魚與雄魚1∶1的比例于放入繁殖缸內,次日清晨收集受精卵,加入1%的亞甲基藍溶液,然后放入28 ℃培養箱中培養。24 h后取出皮膚熒光斑馬魚胚胎,放置于1 mg/mL的鏈霉蛋白酶溶液中約1 min左右,脫去皮膚熒光斑馬魚胚胎外層的卵膜,將脫去卵膜的皮膚熒光斑馬魚胚胎隨機分成空白對照組、溶劑對照組、甲硝唑組、甲硝唑+VC組和甲硝唑+異綠原酸A組(25、50、100 μg/mL),每組胚胎7個,同時設置2個重復孔,加入24孔板中,每組實驗進行三次。根據實驗分組,在空白和溶劑對照組加入2 mL培養水,溶劑對照組再加入5 μL的DMSO,甲硝唑組直接用新鮮培養水配成0.01 mol/L的甲硝唑溶液,甲硝唑組、異綠原酸A組(25、50、100 μg/mL)和VC組(100 μg/mL)分別加入2 mL 0.01 mol/L的甲硝唑溶液,同時VC組按照各自的濃度加入不同量的40 μg/mL的VC溶液,將異綠原酸A用DMSO先配制成40、20、10 mg/mL的母液,再每組加5 μL母液,搖勻,置于28 ℃的恒溫培養箱中培養24 h之后,將皮膚熒光斑馬魚用間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽(MS222)麻醉后拍照,在熒光顯微鏡下觀察皮膚熒光斑馬魚的生長情況以及皮膚角質細胞的數量,并利用Imagepro-plus軟件統計各條皮膚熒光斑馬魚的皮膚熒光點數量,再用SPSS 13.0對數據進行統計分析。

SA(%)=(N2-N1)/(N0-N1)×100

式中,SA為相對抗氧化能力,N0為溶劑對照組角質細胞數量,N1為甲硝唑組熒光角質細胞數量,N2為給藥組熒光角質細胞數量。

2 結果與分析

2.1異綠原酸A的結構確定

分析氫譜和碳譜數據得其中一種化合物為異綠原酸A,純度為93.75%(白色粉末,ESI-MS-m/z 515.4[M-H]-(C25H24O12);1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ-7.51(1H,d,J=14.8 Hz,H-7′),7.43(1H,d,J=14.8 Hz,H-7″),7.06(2H,d,J=5.6 Hz,H-2′,2″),6.97(2H,d,J=6.4 Hz,H-6′,6″),6.78(2H,brs,H-5′,5″),6.23(1H,d,J=15.8 Hz,H-8′),6.19(1H,d,J=15.8 Hz,H-8″),5.33(1H,m,H-5),5.13(1H,m,H-3),3.84(1H,s,H-4),2.14(1H,m,H-6α),1.99(2H,m,H-2),1.91(1H,m,H-6β);13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ-72.9(C-1),36.2(C-2),71.1(C-3),68.0(C-4),71.4(C-5),35.2(C-6),175.8(C-7),126.1(C-1′),126.0(C-1″),115.2(C-2′),114.6(C-2″),145.2(C-3′,3″),148.9(C-4′),148.7(C-4″),116.3(C-5′,5″),166.1(C-9′),166.6(C-9″),121.7(C-6′,6″),146.1(C-7′),145.6(C-7″),116.2(C-8′),115.3(C-8″)。該化合物波譜數據與文獻[19]報道的3,5-O-二咖啡酰奎寧酸即異綠原酸A數據基本一致,故鑒定化合物為異綠原酸A。

圖1 不同濃度樣品對DPPH·的清除作用Fig.1 Scavenging effect of DPPH· in different concentration samples

2.2異綠原酸A的DPPH自由基清除活性

異綠原酸A的DPPH自由基清除活性結果如圖1所示,在該實驗濃度0.5～10 μg/mL范圍內,異綠原酸A對DPPH·的清除作用隨濃度的升高而逐漸增強,呈現明顯的劑量-濃度效應。600 μg/mL VC的DPPH·清除率達到99.00%,而異綠原酸A在濃度僅為10 μg/mL時清除率即接近于100%(97.04%),這說明異綠原酸A具有比VC更強的DPPH·清除作用。

2.3異綠原酸A的羥基自由基清除活性

異綠原酸A的羥基自由基清除活性結果如圖2所示,在該實驗濃度0.5～10 μg/mL范圍內,異綠原酸A對羥基自由基的清除率隨濃度升高而逐漸增大,異綠原酸A在10 μg/mL時,其清除率為60.01%,而VC濃度在200～1000 μg/mL范圍內清除率均在20.00%左右,未發生明顯變化。故實驗表明異綠原酸A表現出高于VC的良好的羥基自由基清除能力。

異綠原酸A對DPPH自由基和羥基自由基具有良好的清除作用,這可能是因為異綠原酸A本身的酚羥基結構極易與自由基反應,提供質子和電子使其失去反應活性,故具有顯著的抗氧化特性[20]。

圖2 不同濃度的樣品對羥基自由基的清除作用Fig.2 Scavenging effect of ·OH in different concentration samples

2.4異綠原酸A的超氧自由基清除活性

異綠原酸A的超氧自由基清除活性結果如圖3所示,異綠原酸A濃度從5 μg/mL升高到200 μg/mL時,其對超氧自由基的清除率從20.39%上升到28.04%,未出現明顯的劑量依賴性。VC濃度從5 μg/mL升高到200 μg/mL時,其對超氧自由基的清除率從41.70%上升到60.00%。異綠原酸A與陽性對照組(VC)相比較而言,其清除超氧自由基的作用明顯較弱。說明異綠原酸A清除超氧自由基的能力較弱。研究發現,異綠原酸A能夠抑制黃嘌呤氧化酶活性,使得次黃嘌呤氧化為黃嘌呤、再氧化為尿酸的過程中所產生的超氧陰離子減少[21],這可能是異綠原酸A清除超氧自由基的機制。

圖3 異綠原酸A和VC對超氧自由基的清除率Fig.3 Scavenging effect of · in isochlorogenic acid A and VC

2.5異綠原酸A的還原能力測定

異綠原酸A的還原力實驗結果如圖4所示,異綠原酸A和VC的OD值在0.5～100 μg/mL濃度范圍內,隨著樣品濃度的增大而增大,OD值越大,其還原力越大,且異綠原酸A的OD值曲線稍高于VC,說明異綠原酸A的還原能力稍強于VC,具有強的還原力,其中異綠原酸A的OD值最高可達0.98。

圖4 不同濃度樣品的還原力測定Fig.4 Determination of reducing power of different concentration samples

2.6異綠原酸A的體內抗氧化活性

異綠原酸A對皮膚熒光斑馬魚皮膚細胞生成的影響見表1,溶劑對照組中,皮膚熒光斑馬魚的皮膚熒光點最多(圖5A),加入甲硝唑后絕大部分熒光點消失(圖5B),同時加入VC和不同濃度的異綠原酸A溶液后,熒光點數量明顯地增多(圖5C～F),而隨著異綠原酸A濃度的增加,熒光點數逐漸減少,說明異綠原酸A的抗氧化能力在25 μg/mL下可能效果更明顯,隨著濃度增加抗氧化能力反而下降,說明異綠原酸A的體內抗氧化作用可能存在劑量窗。體內實驗結果也顯示異綠原酸A具有抗氧化活性。異綠原酸A與甲硝唑共孵育后,皮膚熒光斑馬魚皮膚上的熒光點數量比甲硝唑組明顯增多,說明異綠原酸A具有明顯的抗氧化活性。隨著異綠原酸A濃度的增加,皮膚熒光斑馬魚皮膚細胞逐漸減少,說明在本實驗濃度范圍內,異綠原酸A的抗氧化活性隨著濃度的升高而降低,這說明異綠原酸A的抗氧化活性呈現hormesis現象。在低于25 μg/mL濃度下,抗氧化活性比較強,隨著濃度增加,雖然與模型組(甲硝唑組)相比呈現抗氧化活性,但是比低濃度組的抗氧化活性低,說明異綠原酸A可能逐漸呈現出與甲硝唑的協同促凋亡活性。

表1 異綠原酸A對皮膚熒光斑馬魚皮膚細胞生成的影響Table 1 Effect of flavonoids on the skin fluorescent zebrafish embryo formation by isochlorogenic acid A

注:***表示與甲硝唑組相比,加入樣品后皮膚熒光斑馬魚的熒光數量具有顯著性,且p<0.001。

圖5 異綠原酸A對皮膚熒光斑馬魚抗氧化活性的影響Fig.5 Effects of Isochlorogenic acid on oxidation in zebrafish embryo by isochlorogenic acid A注:A,溶劑對照組;B,0.01 mol/L甲硝唑組;C,0.01 mol/L甲硝唑+VC 100 μg/mL組;D：0.01 mol/L甲硝唑+異綠原酸A 25 μg/mL組;E：0.01 mol/L甲硝唑+異綠原酸A 50 μg/mL組;F：0.01 mol/L甲硝唑+異綠原酸A 100 μg/mL組。

3 結論

從忍冬根中提取異綠原酸A并初步研究了異綠原酸A的體內外抗氧化活性。通過DPPH法、水楊酸比色法、鄰苯三酚自氧化法及還原力測定法說明異綠原酸A對DPPH和羥基自由基表現出良好的清除作用,而超氧自由基清除率較弱,還原力測定值高于VC,具有強還原能力;利用皮膚熒光斑馬魚模型進行的體內實驗說明異綠原酸A能夠恢復甲硝唑所致的皮膚損傷,具有體內抗氧化活性。異綠原酸A具有良好的體內體外抗氧化活性,本研究為食品中無毒且有效抗氧化成分的開發提供了依據。

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StudyontheantioxidantactivityofisochlorogenicacidA

HOUCai-ping1,2,HANLi-wen2,3,ZHANGFeng1,2,CHUJie2,3,ZHANGXuan-ming2,3,WANGRong-chun2,3,CHENXi-qiang2,3,WANGDai-jie4,LIUKe-chun2,3,TIANQing-ping1,*,HEQiu-xia2,3,*

(1.School of pharmacology,Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China; 2.Biology Institute of Shandong Academy of Sciences,Key Laboratory of Shangdong Academy ofSciences,Shangdong Provincial Engineering Laboratory for Biological Testing Technology,Ji’nan 250014,China; 3.Shangdong Provincial Key laboratory of Biosensors,Ji’nan 250014,China; 4.Shandong Analysis and Test Center,Ji’nan 250014,China)

isochlorogenic acid A;zebrafish;antioxidant activities;free radical

2016-11-05

侯彩平(1991-),女,碩士研究生,研究方向:藥劑學,E-mail:hcp071003@163.com。

*通訊作者:田青平(1968-),女,博士，教授,研究方向:經皮給藥吸收機理及新劑型的研究,E-mail:tianqp123456@163.com。 何秋霞(1980-),女,博士,研究員,研究方向:藥物篩選,E-mail:heqx@sdas.org。

國家自然科學基金青年基金(31400979);海洋公益性行業科研專項(201505030-2)。

TS255.1

:A

:1002-0306(2017)12-0072-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.12.013