蛤蚧定喘丸中十種非法染色物的檢測

羅軼　丘明明　何頌華

[摘要] 目的 建立高效液相色譜法（HPLC）檢測蛤蚧定喘丸中非法添加色素金胺O、檸檬黃、胭脂紅、日落黃、亮黃、酸性紅、甲基橙、金橙Ⅱ、赤蘚紅、堿性橙的方法，并用LC-MS/MS確證。 方法 樣品用50%乙醇溶液提取，HPLC測定，流動(dòng)相為乙腈-0.01 mol/L乙酸銨溶液（含0.5%冰乙酸），梯度洗脫，檢測波長420 nm和500 nm。用LC-MS/MS進(jìn)行確證，流動(dòng)相為乙腈-0.01 mol/L乙酸銨溶液，梯度洗脫，離子源：ESI，掃描模式：正離子，在動(dòng)態(tài)MRM模式下，以保留時(shí)間和質(zhì)荷比對分離的組分給予定性。 結(jié)果 十種染色物線性相關(guān)系數(shù)均>0.999，定量限在0.3～2.8 μg/g，回收率為96.3%～101.1%，RSD為0.6%～1.5%。123批次樣品33批次檢出金胺O。 結(jié)論 液質(zhì)聯(lián)用法定性準(zhǔn)確、可靠，液相色譜含量測定法簡便、快速、準(zhǔn)確，兩者相結(jié)合可快速、準(zhǔn)確、靈敏地檢測出蛤蚧定喘丸中十種染色物。

[關(guān)鍵詞] 蛤蚧定喘丸；非法染色；金胺O；高效液相色譜法；液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)

[中圖分類號(hào)] R927 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）05（c）-0139-05

[Abstract] Objective To establish a quantification method of HPLC for determining illegally added auramine O， lemon yellow， carmine， sunset yellow， brilliant yellow， acid red， methyl orange， orange Ⅱ， etythrosine and alkaline orange in Gejie Dingchuan Pills， and validate with LC-MS/MS method. Methods The sample was extracted by 50% ethanol， and determined by HPLC with a gradient elution of acetonitrile-0.01 mol/L ammonium acetate （contain 0.5% glacial acetic acid） and the detection wavelength was set at 420 nm and 500 nm. The identification was performed by LC-MS/MS， using a gradient elution of acetonitrile-0.01 mol/L ammonium acetate. The analytes were detected by an electro spray ionization tandem mass spectrometry with dynamic MRM. Qualitation of the auramine O based on the retention time and mass charge ratio. Results The calibration curve of ten dyes showed good linearity and correlation coefficients were all above 0.999， the limits of quantitation for ten dyes in samples were between 0.3-2.8 μg/g， and the average recoveries ranged from 96.3% to 101.1% with RSD of 0.6%-1.5%. Auramine O could be detected in 33 of 123 samples. Conclusion LC-MS/MS method is accurate and reliable for the qualitative identification and the HPLC method is simple， rapid and accurate for the content determination. The combination of HPLC and LC-MS/MS can detect ten dyes in Gejie Dingchuan Pills rapidly， accurately and sensitively.

[Key words] Gejie Dingchuan Pills； Illegal dyeing； Auramine O； HPLC； LC-MS/MS

近年來，部分不法商販將質(zhì)量較差或二次提取的藥材經(jīng)工業(yè)染料染色美化后，冒充或摻入質(zhì)量較好的飲片中。這樣的中藥材（飲片）不僅治療效果差，其帶入的工業(yè)染料對人體的肝腎有毒副作用，甚至有致畸、致癌、致突變的作用[1-6]。因此，加強(qiáng)中藥材（飲片）非法染色監(jiān)管非常必要。

蛤蚧定喘丸以原粉入藥，處方中含有黃連、黃芩等2味藥材[7]，據(jù)報(bào)道[8-19]，市場上銷售的黃連、黃芩常被非法染色，黃色、橙色和紅色類著色劑占有較大比重[20]，而以上染色劑的檢測尚無國家標(biāo)準(zhǔn)，不能檢測生產(chǎn)企業(yè)是否以“染色藥材（飲片）”投料并引入成藥中，給用藥安全帶來隱患。因此，本文研究了十種染色物的HPLC定量檢測方法，并對檢出的成分用LC-MS/MS法確證，為違規(guī)使用“染色藥材（飲片）”進(jìn)行中成藥生產(chǎn)的監(jiān)管提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters Acquity超高壓高效液相色譜儀；Agilent LC-MS QQQ-6460質(zhì)譜儀。

1.2 試藥

對照試劑：金胺O（檢查用，批號(hào)：111770-200701，含量為87.03%）、金橙Ⅱ（檢查用，批號(hào)：111769-200701，含量為99.40%）、赤蘚紅（檢查用，批號(hào)：111772-200701，含量為97.38%）、酸性紅73（檢查用，批號(hào)：111773-200701，含量為97.77%）、胭脂紅（檢查用，批號(hào)：111771-200701，含量為99.66%）均由中國食品藥品檢定研究院提供，檸檬黃[GBW（E）100001a，0.50 mg/mL]、日落黃[GBW（E）100003a，0.50mg/mL]均由中國計(jì)量科學(xué)研究院提供，亮黃（上海安譜科學(xué)儀器有限公司，CFFC-A0783-25G，含量為96.69%），甲基橙（廣州化學(xué)試劑廠，分析純，含量為99.31%），堿性橙（上海安譜科學(xué)儀器有限公司，CFFC-A0865-25G，含量為99.94%），乙腈（色譜純，F(xiàn)isher），水為高純水，其他試劑均為分析純。蛤蚧定喘丸為吉林省8家、廣東省2家、天津市1家共11家企業(yè)在2010～2011年生產(chǎn)的123批樣品。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

混合對照品溶液制備：分別精密稱取檸檬黃、胭脂紅、日落黃、亮黃、酸性紅73、甲基橙、金橙Ⅱ、金胺O、赤鮮紅、堿性橙對照試劑，加50%乙醇制成每毫升分別含7.5、3、7.5、1、2、2、2、1、3、0.5 μg的混合溶液，搖勻，即得，作為液相色譜分析；另精密稱取金胺O對照試劑適量，加甲醇制成每毫升含100 ng的溶液，即得，作為LC-MS/MS確證分析。

供試品溶液的制備：取本品水蜜丸，研細(xì)，或大蜜丸剪碎，精密稱取約0.8 g，置錐形瓶中，精密加入50%乙醇10 mL，稱定重量，超聲處理（功率400 W，頻率40 kHz）5 min，再稱定重量，用50%乙醇補(bǔ)足減失的重量，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2 HPLC檢測

2.2.1 色譜條件 色譜柱：CAPCELL PAK MGⅡ C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A為乙腈，B為0.01 mol/L乙酸銨溶液（含0.5%冰乙酸），梯度洗脫，0～20 min，A5%，B95%；20～25 min，A5%→50%，B95%→50%；25～30 min，A50%→70%；B50%→30%；30～31 min，A70%→5%，B30%→95%；31～45 min，A5%，B95%；檢測波長為420 nm和500 nm。理論板數(shù)按金胺O峰計(jì)算應(yīng)不低于150 000。

2.2.2 線性范圍的考察 精密稱取金胺O 10.95 mg、堿性橙5.97 mg、亮黃11.56 mg、酸性紅7322.86 mg、甲基橙20.04 mg、金橙Ⅱ24.99 mg、胭脂紅31.25 mg和赤蘚紅35.68 mg，置同一個(gè)100 mL量瓶中，加50%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照試劑貯備液；分別精密量取對照試劑貯備液0.20、0.50、1.00 mL，分別置100 mL量瓶中，另依次精密量取檸檬黃和日落黃各0.30、0.70、1.50 mL，分別置上述100 mL量瓶中，加50%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線1、2、3；分別精密量取對照試劑貯備液0.50、1.00 mL，分別置15 mL量瓶中，另依次精密量取檸檬黃和日落黃各0.75、1.5 mL，分別置上述15 mL量瓶中，加50%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線4、5；精密吸取以上溶液10 μL，注入高效液相色譜儀進(jìn)行測定，以對照試劑濃度為橫坐標(biāo)（X）、峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對照品溶液10 μL，按“2.2.1”的色譜條件，連續(xù)測定6次，結(jié)果10個(gè)對照試劑的峰面積RSD均<1.0%（n = 6），表明儀器的精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取混合對照品溶液10 μL，分別于0、2、4、12、27 h，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果10個(gè)對照試劑的峰面積RSD均<1.5%（n = 5），試驗(yàn)表明，在27 h內(nèi)，被測物穩(wěn)定。

2.2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品（批號(hào)：20100601），按“2.1”項(xiàng)下的方法平行測定6份，結(jié)果僅檢出金胺O，6份含量的平均值為0.91 μg/g，RSD=1.5%，結(jié)果表明，本法的重復(fù)性較好。

2.2.6 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知含量的蛤蚧定喘丸供試品（僅檢出金胺O，含量為0.9051 μg/g）約0.8 g共6份，每份分別精密加入混合對照品溶液10 mL[金胺O、檸檬黃、胭脂紅、日落黃、亮黃、酸性紅73、甲基橙、金橙Ⅱ、赤蘚紅、堿性橙加入濃度（μg/mL）依次為0.953、7.49、3.36、7.49、1.12、2.24、1.99、2.49、3.48、0.597]，按“2.1”項(xiàng)下的方法提取、測定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1，符合方法學(xué)要求。

2.2.7 定量限 通過逐級(jí)稀釋各對照品溶液質(zhì)量濃度，進(jìn)樣測定，確定十種對照試劑的定量限，結(jié)果見表1。

2.2.8 樣品測定 按“2.2”項(xiàng)下的方法，測定了本品11家企業(yè)的123批樣品中十種染色物的含量，結(jié)果有6家企業(yè)46批次疑似檢出金胺O，為避免假陽性，采用LC-MS/MS法對疑似檢出批次的金胺O進(jìn)行確證。其他九種染色試劑未檢出。

2.3 LC-MS/MS確證

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）；流動(dòng)相：A為乙腈，B為0.01 mol/L乙酸銨溶液，梯度洗脫：0～4 min，A10%→90%，B90%→10%，4～9 min，A90%，B10%，7～7.5 min，A90%→10%，B10%→90%；平衡時(shí)間6 min，流速0.3 mL/min，柱溫35℃。

2.3.2 質(zhì)譜條件 質(zhì)譜裝配電噴霧電離源（ESI），干燥氣溫度：350℃；霧化器壓力：40Psi；干燥氣流速：5 L/min，鞘流氣溫度：350℃；鞘流氣流速：9 L/min，毛細(xì)管電壓：4000 V；噴嘴電壓：500 V；駐留時(shí)間：40 ms；檢測模式：正離子檢測，掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）。見表2。

2.3.3 檢出限 通過逐級(jí)稀釋對照品溶液質(zhì)量濃度，進(jìn)樣測定，確定金胺O的檢出限為（S/N=3）為0.3 ng/g。

2.3.4 樣品測定 對以上在HPLC色譜條件下檢出和疑似檢出金胺O的樣品，分別按上述LC-MS/MS條件檢驗(yàn)，結(jié)果有5家企業(yè)33批樣品金胺O的保留時(shí)間與金胺O對照品的保留時(shí)間一致（±2.5%），且樣品中金胺O兩對離子對應(yīng)的色譜峰相對豐度比，在金胺O對照品兩對離子對應(yīng)的色譜峰相對豐度比的最大允許偏差范圍內(nèi)，為陽性；13批樣品經(jīng)LC-MS/MS確證為陰性。

對以上確證檢出的33批樣品，用HPLC測定含量，結(jié)果含量在0.31～14 μg/g之間，檢出率為26.8%。見圖1～4。

3 討論

在HPLC方法研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)難點(diǎn)在于流動(dòng)相極性對檸檬黃與日落黃分離的影響，黃柏、黃連中有效成分鹽酸小檗堿對酸性橙Ⅱ、金胺O保留時(shí)間的干擾。在選用實(shí)驗(yàn)所用流動(dòng)相及洗脫方法后，問題得到有效解決。

實(shí)驗(yàn)采用Agilent Optimizer質(zhì)譜條件優(yōu)化軟件對化合物的碰撞能量及碎裂電壓進(jìn)行自動(dòng)優(yōu)化，選擇響應(yīng)較大的m/z 268→147；m/z 268→131為采集離子對，其中m/z 268→147為定量離子。同時(shí)還手動(dòng)對干燥氣溫度、鞘流氣溫度、鞘流氣流速、毛細(xì)管電壓、離子噴霧電壓等離子源條件進(jìn)行了優(yōu)化。

蛤蚧定喘丸處方中藥味較多，且以原粉直接入藥，引入的金胺O來源于原藥材。在檢驗(yàn)的123批樣品中，有33批樣品中檢出金胺O，而同企業(yè)的某些批次樣品卻未檢出金胺O，表明部分企業(yè)藥材來源不一，質(zhì)量參差不齊，應(yīng)采用相對固定原藥材的進(jìn)貨渠道，進(jìn)行動(dòng)態(tài)管理，同時(shí)監(jiān)管部門應(yīng)加強(qiáng)對中藥材的市場監(jiān)管，從源頭上控制中成藥的質(zhì)量，保證人民的用藥安全。

本研究針對可能非法添加色素的制劑，先以HPLC直接測定，出現(xiàn)陽性樣品或疑似樣品時(shí)，用靈敏度高的LC-MS/MS法進(jìn)行快速確證，保證結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠。本方法為快速測定“染色藥材（飲片）”是否用于蛤蚧定喘丸生產(chǎn)提供了可靠依據(jù)，也為監(jiān)管部門提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持。

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（收稿日期：2017-01-15 本文編輯：李亞聰）