根皮苷對糖基化低密度脂蛋白誘導大鼠視網(wǎng)膜微血管內皮細胞表達乳脂肪球表皮生長因子8的影響

張世陽，徐修才，焦莉莉，顧永昊，談敏

(安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院，a 老年醫(yī)學科,b 中心實驗室,c 眼科，合肥 230001)

·基礎研究·

根皮苷對糖基化低密度脂蛋白誘導大鼠視網(wǎng)膜微血管內皮細胞表達乳脂肪球表皮生長因子8的影響

張世陽a，徐修才b，焦莉莉a，顧永昊c，談敏a

(安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院，a 老年醫(yī)學科,b 中心實驗室,c 眼科，合肥 230001)

目的 研究根皮苷(PHL)對糖基化低密度脂蛋白(gly-LDL)誘導大鼠視網(wǎng)膜微血管內皮細胞(RMVEC)表達乳脂肪球表皮生長因子8(MFG-E8)的影響，探討PHL治療糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)的作用及其機制。方法 體外培養(yǎng)大鼠RMVEC，分別進行不同濃度的gly-LDL與聯(lián)合PHL+gly-LDL的處理。采用TUNEL方法觀察不同處理條件下大鼠RMVEC的細胞凋亡。利用蛋白質免疫印跡方法(Western blotting)檢測大鼠RMVEC 表達MFG-E8的變化。結果 與對照組相比，gly-LDL誘導大鼠RMVEC發(fā)生明顯的細胞凋亡形態(tài)學變化，凋亡細胞的比例顯著增多達到36.52%(P<0.01)，預先經(jīng)PHL(800 μmmol/L)孵育后，細胞凋亡明顯減少至20.45%(P<0.01)；與對照組(蛋白表達灰度值0.290±0.008)比較，gly-LDL誘導組蛋白MFG-E8表達明顯降低，并呈現(xiàn)濃度依賴性(蛋白表達灰度值分別為0.215±0.009、0.165±0.002、0.117±0.014與0.092±0.004，P<0.01)；經(jīng)PHL預處理后，gly-LDL誘導的MFG-E8表達明顯升高，伴隨PHL給藥濃度的增加，MFG-E8的表達逐漸上調，差異有統(tǒng)計學意義(蛋白表達灰度值分別為0.343±0.008、0.373±0.002與0.404±0.006，P<0.01)。結論 PHL可能通過顯著改善蛋白MFG-E8的表達，從而抑制gly-LDL誘導的大鼠RMVEC的細胞凋亡，實現(xiàn)對DR的保護作用。

糖尿病視網(wǎng)膜病變;根皮苷;脂蛋白類,LDL;表皮生長因子;大鼠,Sprague-Dawley

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一，也是成年人群中視力損害與致盲的主要病因。DR的發(fā)病機制非常復雜，有研究認為，糖尿病環(huán)境中長期的高血糖以及脂質代謝異常導致低密度脂蛋白過度的糖基化，后者介導與促進血管內皮細胞的凋亡與內皮功能障礙是DR發(fā)生與發(fā)展的重要病理生理機制[1-3]。乳脂肪球表皮生長因子8(MFG-E8)最初認為是小鼠乳腺上皮細胞表面分泌的一種外周蛋白，晚近的研究發(fā)現(xiàn)MFG-E8參與了細胞凋亡、細胞外基質重塑以及炎癥介導等多種生物學功能[4]。前期的蛋白質組學研究表明[5]，蛋白MFG-E8在db/db糖尿病小鼠視網(wǎng)膜組織表達明顯下調，提示MFG-E8可能與DR密切相關。根皮苷(PHL)是一種來源于蘋果類植物的天然藥物，其治療DR的作用已有多項基礎研究結果證實[6-7]。本實驗研究PHL對于糖基化低密度脂蛋白(gly-LDL)誘導大鼠視網(wǎng)膜微血管內皮細胞(RMVEC)表達MFG-E8的影響，以探討PHL治療DR的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物、試劑與藥品 雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠來源于常州卡文斯實驗動物有限公司，RPMI1640、M199培養(yǎng)基來源于美國Hyclone公司、TUNEL試劑盒購自瑞士Biotool公司、BCA蛋白定量試劑盒購自江蘇凱基公司、鼠MFG-E8抗體購自英國Abcom公司、兔抗大鼠因子Ⅷ多克隆抗體與兔抗大鼠CD31多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，PHL購自中國天津尖峰天然藥物研究開發(fā)有限公司(批號：1005004-19，純度98%)。

1.1.2 儀器 細胞培養(yǎng)箱(Thermo Scientific 8000)、倒置拍照顯微鏡(Leica DMI3000B)、電泳儀(Bio-Rad Mini Protean 3 Cell)、電轉儀(大連競邁PS-9)與酶標儀(Thermo MK3)。

1.2 方法

1.2.1 體外分離、培養(yǎng)與鑒定大鼠RMVEC 體外分離大鼠視網(wǎng)膜以及體外培養(yǎng)大鼠RMVEC方法同文獻[8]，利用倒置顯微鏡觀察原代RMVEC的細胞形態(tài)。

1.2.2 大鼠RMVEC的體外鑒定 將培養(yǎng)的RMVEC接種于放油載玻片的培養(yǎng)皿中，至細胞爬滿載玻片80%時棄培養(yǎng)液，取出培養(yǎng)皿，加入PBS 300 μL清洗2遍，加入150 μL 4% 多聚甲醛固定液，室溫固定30 min。加入150 μL 0.1% Triton x-100，室溫靜置15 min。再加入300 μL的PBS，靜置5 min。然后加入200 μL 5% BSA封閉液，置于37 ℃，5 % CO2培養(yǎng)箱1 h。分別加入50 μL兔抗大鼠CD31多克隆抗體(1∶50稀釋)和兔抗大鼠因子Ⅷ多克隆抗體(1∶50稀釋)，4 ℃過夜孵育。PBS洗滌后滴加FITC標記的羊抗兔二抗(1∶50稀釋)，37 ℃孵育1 h。PBS甘油封片后熒光顯微鏡下觀察。RMVEC純度=免疫陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)。

1.2.3 gly-LDL的制備 LDL的糖基化制備方法參考文獻[9]。制備的gly-LDL分裝EP管氮氣密封4 ℃避光保存。

1.2.4 細胞凋亡的檢測 RPMI1640完全培養(yǎng)基將PHL稀釋為800 μmol/L，將gly-LDL稀釋為100 μg/mL進行實驗。PHL提前與RMVEC預先孵育4 h，然后加入gly-LDL孵育48 h。實驗分3組：對照組、gly-LDL組以及gly-LDL聯(lián)合PHL組。TUNEL操作參考Biotool試劑盒說明書，軟件ImageJ計算各組RMVEC細胞凋亡率。

1.2.5 RMVEC細胞表達蛋白MFG-E8的檢測 分別進行兩個階段的獨立實驗檢測不同處理條件下細胞蛋白MFG-E8的表達。實驗分組一分為5組：空白對照組、gly-LDL 12.50、25.00、50.00與100.00 mg/L四個藥物濃度組。實驗分組二分為5組：空白對照組(CK)以及CK+gly-LDL、CK+gly-LDL+PHL 200 μmol/L、CK+gly-LDL+PHL 400 μmol/L與CK+gly-LDL+PHL 800 μmol/L(實驗分組二中各組gly-LDL濃度均為100 mg/L)。按照Western blotting常規(guī)操作，包括各組細胞總蛋白提取濃度測定、SDS-PAGE制備上樣電泳、轉膜、目標蛋白抗體孵育以及顯色等標準流程檢測各相應分組RMVEC細胞MFG-E8蛋白表達的變化。并利用各顯色條帶的灰度值進行半定量分析。

2 結果

2.1 原代大鼠RMVEC的形態(tài)學特征 原代培養(yǎng)的RMVEC在24 h細胞貼壁生長，形狀為梭形、三角形或多角形。5 d左右形成細胞集落。10 d后細胞融合，呈現(xiàn)鋪路石樣生長,見圖1。

圖1 原代大鼠RMVEC的形態(tài)學特征(×100)

2.2 原代大鼠RMVEC的體外鑒定 免疫熒光細胞染色顯示，因子Ⅷ免疫熒光染色，細胞核周圍出現(xiàn)較強的黃綠色熒光反應。CD31因子免疫熒光染色，細胞呈現(xiàn)特異性黃綠色熒光。大部分活細胞為免疫陽性細胞，純度達到90%以上。見圖2。

2.3 gly-LDL對大鼠RMVEC細胞凋亡的作用以及PHL的影響 對照組RMVEC細胞凋亡率為1.24%，gly-LDL(100 mg/L)誘導48h的RMVEC細胞凋亡率達到36.52%，經(jīng)χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，gly-LDL(100 mg/L)誘導組的細胞凋亡率顯著高于對照組。PHL(800 μmmol/L)預先孵育后RMVEC細胞凋亡率為20.45%，與gly-LDL(100 mg/L)誘導組細胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，PHL (800 μmmol/L)預先孵育RMVEC可顯著降低細胞的凋亡。見圖3。

2.4 gly-LDL對大鼠RMVEC細胞表達MFG-E8的影響 與對照組比較，gly-LDL處理48 h可導致RMVEC細胞表達MFG-E8顯著下調，隨著gly-LDL濃度的增加，MFG-E8的表達逐漸下調，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖4。

2.5 PHL對大鼠RMVEC表達MFG-E8的影響 與對照組(CC)比較，gly-LDL誘導明顯下調RMVEC細胞的MFG-E8表達(P<0.01)，PHL預先孵育48 h可以顯著上調gly-LDL誘導的RMVEC細胞MFG-E8表達，隨著PHL給藥濃度的增加，MFG-E8的表達逐漸上調，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖5。

與對照組比較，aP<0.01；與gly-LDL組比較，bP<0.01

圖3 gly-LDL(100 mg/L)對大鼠RMVEC細胞凋亡的作用以及PHL(800 μmmol/L)的影響

與對照組比較，aP<0.01

A：柱狀圖；B：電泳圖

圖2 原代大鼠RMVEC的體外鑒定(免疫熒光細胞染色，×200)

CC組為對照組；CC+gly-LDL組為gly-LDL誘導組；PHL 200組為聯(lián)合PHL 200 μmmol/L組；PHL 400組為聯(lián)合PHL 400 μmmol/L組；PHL 800組為聯(lián)合PHL 800 μmmol/L組；與對照組比較，aP<0.01

圖5 PHL對大鼠RMVEC表達MFG-E8的影響

3 討論

DR是糖尿病在眼部的最重要并發(fā)癥，現(xiàn)已成為成年人群中視力漸進性損害與致盲的主要病因。隨著全球范圍內糖尿病患病率的日益升高以及糖尿病病程的自然延長，DR給患者、家庭以及社會帶來更多的危害與負擔。研究[10]表明，嚴格的血糖控制能顯著減低DR進展的風險，但在臨床實踐中長期控制血糖達標并非易事，而可能發(fā)生低血糖事件帶來的危害更有可能抵消血糖良好控制的獲益。激光光凝治療DR效果確切，仍是中晚期階段DR治療的重要方法，但存在很多局限性與不良反應，如導致視力減退、視野損傷、暗適應和對比敏感度下降等，從而限制了其在臨床上的廣泛應用。因此，探討DR早期的病理生理機制并尋找有效安全的干預藥物具有重要的意義。

視網(wǎng)膜血管內皮細胞、血管周細胞以及神經(jīng)元、神經(jīng)膠質細胞等凋亡是DR早期的重要病理學基礎，氧化應激損傷在促進細胞凋亡作用中發(fā)揮著重要作用[11]。PHL是一種天然的多酚類化合物，其主要來源于蘋果類的植物種屬。人類認識PHL已有近百年的歷史，最初PHL用于治療發(fā)熱以及感染性疾病，隨后的研究發(fā)現(xiàn)，PHL及其衍生物作為鈉-葡萄糖協(xié)同轉運蛋白(SGLT)抑制劑作用于腎小管SGLT蛋白促進葡萄糖在腎臟的排泄，因此PHL具有調節(jié)血糖的效應以及被作為中介研究腎臟代謝功能。晚近的研究還發(fā)現(xiàn)[12-13]，PHL具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、保肝以及類雌激素樣作用。相關報道與研究為PHL在DR上的應用奠定了實驗與理論基礎。目前已有多個基礎研究深入探討PHL對于DR的影響與作用。Wakisaka等[7]報道，體外培養(yǎng)的牛視網(wǎng)膜血管周細胞在高糖誘導后出現(xiàn)周細胞內葡萄糖過量積聚、膠原蛋白水平升高、DNA合成減少以及周細胞胞體的腫脹等血管周細胞形態(tài)與功能學的異常，PHL的干預可以顯著改善高糖刺激下的周細胞損傷。我們前期的研究在體內動物整體層面觀察了PHL對于糖尿病視網(wǎng)膜損害的影響，選擇C57BLKS/J db/db品系小鼠模擬并建立2型糖尿病DR動物模型并采用PHL干預治療，結果發(fā)現(xiàn)PHL處理能夠明顯減少db/db小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)元細胞的凋亡以及神經(jīng)膠質細胞的增生[5]。本研究模擬糖尿病內環(huán)境即利用gly-LDL刺激下體外培養(yǎng)的大鼠RMVEC導致細胞凋亡顯著增加，PHL預先干預明顯改善RMVEC的細胞凋亡，該實驗結果報道了PHL可以改善gly-LDL誘導的大鼠RMVEC細胞凋亡，實現(xiàn)PHL對于DR的早期保護作用。然而，PHL治療DR的作用分子機制研究尚未闡明。

MFG-E8蛋白即乳脂肪球上皮細胞生長因子，是乳凝集素家族的重要成員。研究發(fā)現(xiàn)MFG-E8參與了細胞遷移、細胞增殖、細胞凋亡、細胞信號轉導、細胞外基質重塑以及炎癥介質等多種生物學功能，并可能在衰老、糖尿病等動脈粥樣硬化性相關疾病中扮演著重要角色。前期基于iTRAQ的蛋白質組定量研究視網(wǎng)膜差異蛋白組發(fā)現(xiàn)，db/db糖尿病小鼠視網(wǎng)膜組織表達蛋白MFG-E8較健康對照組明顯下調，PHL干預后該蛋白顯著回調，提示MFG-E8的代謝失調可能與DR的發(fā)生有著密切關系[5]。本研究在離體培養(yǎng)大鼠RMVEC細胞層面研究gly-LDL刺激下MFG-E8蛋白表達的變化，結果顯示RMVEC細胞在不同濃度的gly-LDL誘導均導致表達MFG-E8的下調，MFG-E8的下調程度且與gly-LDL的濃度呈現(xiàn)劑量依賴性，給予RMVEC預處理PHL可明顯改善gly-LDL誘導的MFG-E8表達下調，并且隨著PHL濃度的升高，該蛋白MFG-E8的表達呈現(xiàn)劑量一致的恢復。MFG-E8介導的PHL保護糖尿病視網(wǎng)膜損傷的詳細作用機制并不清楚。在真實世界的慢性阻塞性肺疾病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡以及類風濕關節(jié)炎等患者血清中MFG-E8水平明顯降低，且與患者的病變嚴重程度成正相關，MFG-8可能通過炎癥介導參與了炎癥相關性疾病的發(fā)生與進展[14-16]。MFG-E8作為連接巨噬細胞與凋亡細胞的橋梁分子在細胞凋亡的過程中發(fā)揮著獨特而重要的作用。Ait-Oufella等[17]研究發(fā)現(xiàn)，缺乏MFG-E8基因表達的小鼠其體內凋亡細胞被吞噬明顯減少，導致凋亡細胞呈現(xiàn)碎片化的堆積，促進了小鼠血管病變的發(fā)生與發(fā)展。凋亡是DR的發(fā)生的病理生理學基礎，氧化應急損傷以及炎癥在DR的進展中也發(fā)揮著舉足輕重的作用，MFG-E8是否通過凋亡、炎癥介導或其他機制參與DR的發(fā)展以及介導PHL對于DR的保護作用，后續(xù)研究將基于RNA干擾技術沉默目的基因深入探討。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)gly-LDL誘導大鼠RMVEC后，能夠導致細胞的凋亡以及細胞表達MFG-E8蛋白的下調，PHL的預處理至少可能通過改善細胞MFG-E8表達的失調抑制RMVEC細胞的凋亡實現(xiàn)對于DR的保護作用。

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Effects of phlorizin on the expression of MFG-E8 in rats retinal microvascular endothelial cells in response to glycated low density lipoproteins

ZhangShiyang*,XuXiucai,JiaoLili,GuYonghao,TanMin

(*DepartmentofGeriatrics,AnhuiProvincialHospital,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230001,China)

Correspondingauthor:XuXiucai,Email:xuxiucai1972@163.com

Objective To study the effects of phlorizin on the expression of MFG-E8 in rats retinal microvascular endothelial cells (RMVEC) in response to glycated low density lipoproteins (gly-LDL).Methods The primary RMVEC in rats were cultured and identified in vitro.The apoptosis of RMVEC induced gly-LDL was estimated using TUNEL.The expressions of MFG-E8 in RMVEC in the absence or presence of phlorizin were determined by Western blotting.Results Gly-LDL caused an obvious apoptosis of RMVEC compared with the control group (36.52% VS. 1.24%,P<0.01),while pretreatment with phlorizin attenuated gly-LDL mediated cells apoptosis significantly (20.45% VS. 36.52%，P<0.01).Moreover,stimulation of RMVEC with different concentrations of gly-LDL(0,12.50,25.00,50.00,100.00 μg/mL) resulted in a significant decrease in the expression of MFG-E8 (P<0.01),while the pretreatment of RMVEC with different concentrations of phlorizin (200,400,800 μmmol/L) significantly restored the gly-LDL induced decreased MFG-E8 levels in a dose dependent manner for 48h (P<0.01).Conclusions Phlorizin could inhibit RMVEC apoptosis in response to gly-LDL,possibly by the up-regulation of the protein MFG-E8 expression.

Diabetic retinopathy;Phlorhizin;Lipoproteins,LDL;Epidermal growth factor;Rats,sprague-dawley

安徽省自然科學基金(1408085MH208)

張世陽，副主任醫(yī)師，Email:shiyangzhang73@163.com

徐修才，副主任技師，Email:xuxiucai1972@163.com

R587.26

A

10.3969/J.issn.1672-6790.2017.04.029

2016-11-16)