督脈電針對慢性腦缺血大鼠記憶能力及食欲素受體1表達的研究

劉丹，劉瑜，羅正凱，王淑榮，陳洪琳，于國強

(1.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，a針灸四科，b血液科，哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫藥大學)

·基礎研究·

督脈電針對慢性腦缺血大鼠記憶能力及食欲素受體1表達的研究

劉丹1a，劉瑜2，羅正凱1b，王淑榮1a，陳洪琳1a，于國強1a

(1.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，a針灸四科，b血液科，哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫藥大學)

目的 探討督脈電針對慢性腦缺血大鼠記憶能力及食欲素受體1(OX1R)所產生的影響。方法 選用70只Wistar大鼠通過分次結扎雙側頸總動脈法建立慢性腦缺血的大鼠模型，分為4組。造模成功后，將實驗大鼠按隨機數字表法分為對照組、模型組、立即針刺組、針刺治療組。對照組不予任何處理，正常飼養；模型組、立即針刺組及針刺治療組又分為1個月、2個月2小組，每組或亞組的大鼠各10只，立即針刺組首次造模即開始進行督脈電針干預，針刺治療組在造模開始后第3周開始進行督脈電針干預。采用水迷宮對大鼠進行行為學評價，同時用免疫組織化學法測定OX1R陽性細胞數。結果 模型組缺血1個月，大鼠學習記憶能力較對照組減退，2個月時較1個月時有所好轉；2個月時針刺治療組學習記憶能力優于模型組，而立即針刺組略優于針刺治療組。模型組于造模開始后1個月OX1R表達高于對照組，2個月時進一步增高；1個月時針刺治療組與模型組相比，OX1R表達差異無統計學意義(P>0.05)，而立即針刺組與模型組相比，OX1R表達有升高(P<0.05)；2個月時針刺治療組與模型組相比OX1R表達有明顯升高(P<0.05)，而立即針刺組與針刺治療組相比OX1R表達有升高(P<0.05)。結論 督脈電針干預后促進了腦組織OX1R的表達，同時發現早期干預對OX1R表達的影響優于正常治療組中OX1R的表達。

缺氧缺血，腦；記憶障礙；電針;大鼠,Wistar

慢性腦供血不足(CCCI)是多種因素(腦動脈粥樣硬化、頸椎骨質增生、精神因素等)綜合作用導致腦組織低灌注，腦部血流速度改變(增快或減慢)，當供應量低于生理需要量就會出現相應敏感區域的病理改變。食欲素受體1(OX1R)是能與orexin-A及orexin-B相結合的G蛋白受體，是主要存在于下丘腦背外側區的一類神經肽[1]，研究表明慢性腦缺血可導致OX1R發生變化[2]，本研究通過結扎雙側頸總動脈法建立慢性腦缺血的大鼠模型，觀察慢性腦缺血大鼠皮質及海馬CA1區的OX1R表達陽性細胞數，同時運用督脈電針早期干預，觀察干預后的療效，并探討其作用機制。

1 材料及方法

1.1 試劑與動物 Wistar大鼠70只，由黑龍江中醫藥大學動物實驗中心提供。大鼠山羊抗多克隆OX1R抗體(200 mg/L)購自Santa Cruz公司，免疫組織化學SP試劑盒購自北京中山生物技術有限公司，CY3標記的山羊、FITC標記的小鼠Ⅱ抗熒光試劑均購自武漢博士德生物試劑公司。

1.2 慢性腦缺血大鼠模型建立及實驗分組 參照劉丹等[3]方法分次永久性結扎大鼠雙側頸總動脈(2VO)制備慢性腦缺血大鼠模型 。將實驗大鼠按隨機數字表法分為對照組、模型組、立即針刺組、針刺治療組。對照組不予任何處理，正常飼養；模型組、立即針刺組及針刺治療組又分為1個月、2個月2小組，每組或亞組的大鼠各10只，立即針刺組首次造模即開始進行督脈電針干預，針刺治療組在造模開始后第3周開始進行督脈電針干預。

1.3 操作方法 通過督脈電針進行干預，采用針刺督脈穴(神庭、百會和風府、大椎)，再接上電療儀，采用持續脈沖電流、疏波、頻率2 Hz、強度2 mA，以頭部出現輕微抖動為最佳，針刺時間20 min，每日同一時間進行1次針刺。

1.4 大鼠的學習記憶能力測試 參照劉丹等[3]方法制作水迷宮,分別于造模成功后的不同時間點游水迷宮同時評價其學習記憶能力，計算大鼠自水迷宮起點到安全臺的終點所用時間(即逃避潛伏期)為評價大鼠學習記憶能力的指標,連續測量5次，并取其平均值。

1.5 腦組織切片的制備與OX1R的表達水平測定

對照組、模型組、立即針刺組及針刺治療組在同一規定時間點分別于造模后1個月、2個月進行標本采集。使用SP染色試劑盒進行免疫組織化學染色,按照試劑盒說明書的操作步驟進行，DAB顯色，需鏡下控制時間，光鏡觀察；OX1R主要表達在海馬CA1區，隨機選擇5個鏡下視野1000個細胞，計算陽性細胞數。

1.6 統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件，應用單因素方差分析、獨立樣本t檢驗及秩和檢驗分析數據。

2 結果

2.1 行為學評價 模型組1個月時慢性腦缺血大鼠逃避潛伏期較對照組明顯延長(P<0.05)；針刺治療組1個月時與模型組1個月時比較，差異無統計學意義(P>0.05)；而立即針刺組1個月時較針刺治療組大鼠的學習記憶能力稍有好轉，差異有統計學意義(P<0.05)；模型組2個月時逃避潛伏期較1個月時稍好轉，差異有統計學意義(P<0.05)；而2個月時針刺治療組較模型組，差異有統計學意義(P<0.05)；立即針刺組2個月時較針刺治療組有好轉，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠逃避潛伏期

注：與對照組比較，aP<0.05；與模型組同時間亞組比較，bP<0.05；與針刺治療組同時間亞組比較，cP<0.05

2.2 OX1R的表達 模型組于造模開始后1個月OX1R表達高于對照組，2個月時進一步增高。在同一時間組中，1個月針刺治療組與模型組相比OX1R表達無明顯差異(P>0.05)，立即針刺組與模型組相比OX1R表達有升高(P<0.05)；2個月時治療組與模型組相比OX1R表達有明顯升高(P<0.05)，而立即針刺組與針刺治療組相比OX1R表達有升高(P<0.05)，見表2。

表2 OX1R陽性細胞數個視野1000個細胞)

注：與對照組比較，aP<0.05；與模型組同一時間亞組比較，bP<0.05；與針刺治療組同時間亞組比較,cP<0.05

3 討論

慢性腦缺血持續時間的長短與其對大腦的認知和中樞神經功能的損壞具有相關性[4]。Siegel等[5]發現食欲素系統有可能與神經的修復有關。采用水迷宮測量慢性腦缺血大鼠逃避潛伏期對其進行行為學評價,水迷宮是評價大鼠學習記憶能力有效的工具,結果顯示模型組缺血1個月，大鼠學習記憶能力較對照組減退，2個月時較1個月時有所好轉；2個月時針刺治療組學習記憶能力優于模型組，而立即針刺組略優于針刺治療組。同時，1個月時，模型組與治療組OX1R表達差異無統計學意義，但模型組與立即針刺組相比較OX1R表達有升高；治療組2個月時OX1R的表達較模型組明顯升高，而立即針刺組與治療組相比，立即針刺組2個月時OX1R的表達較治療組有所上升。目前尚無明確機制解釋這種現象，可能有以下原因：早期腦組織缺血時，應激、免疫及低血糖等反應刺激Orexin-A的釋放，Orexin-A又促進了CRF、神經肽Y和ACTH的升高使糖皮質激素和腎上腺素含量升高。體內過度活化的自主神經系統，過多的NPY、CRF和糖皮質激素對Orexin-A產生強烈反饋抑制作用，加上Orexin-A被體內自由基破壞，使Orexin-A的表達下降，OX1R出現反應性的升高。缺血1個月后體內應激和免疫反應漸減弱，NPY與CRF、糖皮質激素與自由基水平下降，Orexin-A的表達上調，新平衡恢復[6]，OX1R的表達開始下降；在2個月時機體為了促進自身修復，下丘腦表達的OX1R再次升高。OX1R在腦內海馬區及大腦皮層等均有表達[2]，有研究證實皮層和海馬區是缺血后最敏感的區域[7-8]，皮質及海馬與信息的儲存和記憶密切相關[9]，當皮質及海馬區受損后大鼠會出現不同程度的學習記憶能力改變[10]。相關研究[11-16]亦表明督脈電針能夠有效改善腦部血流量、保護腦部組織，進一步促進缺血后神經細胞的再生和存活。本研究發現經過督脈電針干預后對慢性腦缺血大鼠學習記憶能力及皮質和海馬區OX1R的表達均有提高，而早期進行針刺治療對大鼠學習記憶能力及皮質和海馬區OX1R的表達又較針刺治療組有所提高,提示經過督脈電針的干預后能夠對大鼠腦內OX1R的表達情況起到良性的調節作用，提示督脈電針可能對慢性腦缺血大鼠缺血后期導致的大腦的神經細胞的損傷有一定防治作用。

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The study of Du meridian electroacupuncture on the ability to remember and OX1R expression of rats with chronic cerebral ischemia

LiuDan*,LiuYu,LuoZhengkai,WangShurong,ChenHonglin,YuGuoqiang

(*DepartmentⅣofAcupuncture&Moxibustion,FirstAffiliatedHospital,HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China)

Objective To explore the effect of Du meridian electroacupuncture on the memory ability and OX1R expression of mice with chronic cerebral ischemia.Methods The cerebral ischemic models were established by fractionally ligating bilateral carotid arteries.Seventy mice were divided into four groups by random number table method:control,model,immediately acupuncture and acupuncture groups.The behavior of the models was evaluated by water maze.The number of OX1R positive cells was determined by immunohistochemical.Results After 1 month ligation,the memory ability of mice was impaired in model group 1 month later,and improved after 2 months .The memory ability in acupuncture group was better than that in model group,immediately acupuncture group was better than that in acupuncture group,and there was significant difference.The expression level of OX1R of model group was higher than that in control group,and the expression of OX1R was further increased after 2months.There were no significant differences between the model group and the acupuncture group at 1 month,but the expression of OX1R in the immediate acupuncture group was higher than that of model group.The OX1R expression in acupuncture group was higher than model group,and the same result between immediate acupuncture group and acupuncture group after 2 month.Conclusions The Du meridian electroacupuncture promote the brain tissue OX1R expression of mice with chronic cerebral ischemia.

Hypoxia-ischemia;Memory disorders;Electroacupuncture;Rats,Wistar

黑龍江省教育廳科學技術研究項目(12541760)

劉丹,主任醫師,Email:gameckld@126.com

R743

A

10.3969/J.issn.1672-6790.2017.04.028

2016-10-28)