煙草內生真菌多樣性及其細胞毒活性初步研究

李盼盼，袁曉龍，鄭 璇，高 林，劉新民，張忠鋒，張 鵬，申國明*

（1.中國農業科學院煙草研究所，青島 266101；2.中國農業科學院研究生院，北京 100081）

煙草內生真菌多樣性及其細胞毒活性初步研究

李盼盼1,2，袁曉龍1，鄭 璇1,2，高 林1，劉新民1，張忠鋒1，張 鵬1，申國明1*

（1.中國農業科學院煙草研究所，青島 266101；2.中國農業科學院研究生院，北京 100081）

為研究煙草內生真菌的生物多樣性，揭示其在煙草中的分布規律及種群結構，對煙草栽培種的內生真菌進行了系統的分離和鑒定，并對其發酵粗提物進行了初步的細胞毒活性篩選。結果發現，采用組織分離法從健康煙株的根、莖、葉中共分離純化到62株內生真菌，形態學和分子生物學鑒定為4目7科9屬。發現葉部內生真菌的分離率最高，其次為莖，根部最少。采用CCK-8法對內生真菌的體外細胞毒活性進行篩選，發現多數菌株對人腎癌Caki-1細胞和人肝癌HepG2細胞均具有不同程度的抑制活性，菌株TE-6L的PDB發酵液及大米發酵物對Caki-1細胞48 h內的IC50分別為13.28和0.36 μg/mL。結合形態學特征和分子生物學鑒定TE-6L菌株為Fusarium sambucinum。研究表明，煙草中蘊含豐富的具有細胞毒活性的內生真菌資源，為尋找細胞毒活性物質新來源、開發新型抗腫瘤藥物提供了新的途徑。

煙草；內生真菌；種群分布；代謝產物；細胞毒活性

植物內生真菌（endophytic fungi）是指生活于健康植物組織或器官內，并與宿主植物建立了互利共生關系的真菌，是植物體微生態系統的重要組成部分[1]。其普遍分布于各種陸生和水生植物中，如禾草植物[2-4]、藥用植物[5-7]、經濟林木[8]、海洋植物[9-10]等。研究證明，內生真菌在宿主植物的生長發育中起著積極作用，能促進植物生長、誘導植物產生抗病性、提高植物對重金屬的耐性等[11-13]。更為重要的是，在與宿主的協同進化過程中，內生真菌可以代謝產生具有生理活性的物質，如抑菌[14-15]、氧化[16-17]、促生長因子[18-19]、細胞毒[20-21]活性物質等。如STIERLE等[22]從藥用植物短葉紅豆杉樹皮中分離得到一株內生真菌安德氏紫杉霉Taxomycesandreanae，從該菌的發酵產物中分離獲得抗癌藥物紫杉醇（taxol）。隨后，從多種植物中陸續分離到產紫杉醇或其類似物的內生真菌菌株[23-25]。因此，尋找和發掘具有潛在的、高效的細胞毒活性物質的內生真菌資源，為抗腫瘤藥物的研究和開發提供了新的途徑。

煙草（NicotianatabacumL.）作為一種歷史悠久的藥用植物，蘊含著豐富的內生真菌資源。目前關于煙草內生真菌的研究主要集中在促進煙草生長、提高煙株抗重金屬能力、生防抑菌等方面[26-28]，而對其代謝產物生物活性的研究尚未見報道。本試驗在分離鑒定煙草內生真菌的基礎上，首次對其代謝產物的細胞毒活性進行研究，為煙草內生真菌資源的有效利用、開發新型細胞毒活性先導化合物奠定基礎。

1 材料與方法

1.1試驗材料

健康煙草植株，品種為中煙102和云煙97，于2016年6月采于安徽皖南煙草示范園。

1.2試劑與儀器

乙酸乙酯、二甲基亞砜（DMSO）均為分析純，國藥；CCK-8（Sigma 公司），胎牛血清（杭州四季青公司）。

超凈工作臺、CO2培養箱（Heal Force公司），生化培養箱（上海新苗公司），光學顯微鏡（Nikon公司），酶聯免疫測定儀（Thermo公司），立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博迅）。

1.3腫瘤細胞株來源與培養基

人腎癌Caki-1細胞、人肝癌HepG2細胞購于中國科學院細胞庫。腫瘤細胞株采用RPMI 1640及MEM培養基培養，使用前均加入10%胎牛血清。

1.4煙草內生真菌的分離純化

煙草內生真菌的分離采用組織分離法[29]。取健康煙株的根、莖、葉，自來水沖洗后采用75%酒精浸泡消毒2~4 min。將不同組織剪切成0.5 cm×0.5 cm大小的片段，將切口插入PDA培養基上（為抑制細菌的生長，需預先加入質量分數為0.5%的氯霉素），28 ℃培養。在另一平板設置未經過表面消毒的組織作為對照。待培養基中組織切口處長出菌絲后，用滅菌的接種環挑取孢子或菌絲體至新的PDA培養基上，劃線稀釋分離，直至獲得純培養。

1.5內生真菌的形態觀察及分類鑒定

將純化的菌株點植于PDA培養基上，28 ℃恒溫培養，注意觀察菌株的生長速度、菌落大小、質地、邊緣等形態特征，同時觀察分生孢子或菌絲體的顯微結構特征。采用CTAB法提取純化菌株的基因組DNA[30]，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶完整性，利用nanodrop檢測DNA的純度和濃度，以ITS1和ITS4通用引物進行PCR擴增[31]，然后將PCR產物送青島擎科生物工程有限公司利用Sanger測序平臺進行測序。通過BLAST序列比對，最終確定菌株的分類地位[32]。

1.6內生真菌的發酵培養及粗提物浸膏的制備

將不同種屬的20株內生真菌分別接種于PDB液體培養基和大米固體培養基上，室溫靜置發酵30 d。發酵結束后，分別向PDB及大米培養基中加入等積體的乙酸乙酯萃取。萃取3次后過濾，減壓濃縮獲得粗提物浸膏作為活性待測樣品。

1.7細胞毒活性測定

采用CCK-8（Cell Counting Kit-8）法[33]，常規胰酶消化收集對數生長期的人腎癌Caki-1細胞和人肝癌HepG2細胞，按1×105細胞/孔的量分別接種于96孔培養板中，于5% CO2，37 ℃的條件下培養過夜。次日使用100 μL含有不同濃度待測樣品的培養液進行全換液后，同樣條件下繼續培養。24、48 h后，加入10

μL的CCK-8溶液，培養4 h后，用酶標儀在450 nm下進行吸光度（A）測定，以生長抑制率表示腫瘤細胞的增殖抑制活性。

生長抑制率=（1-A1/A2）×100%

其中，A1為樣品組吸光值，A2為對照組吸光值。

1.8數據分析

所有試驗均重復3次，細胞毒活性測試數據均使用均值±標準差（x±s）表示，各組數據采用SPSS 19.0統計軟件進行t檢驗分析。

2 結 果

2.1煙草內生真菌多樣性及菌群組成

從安徽皖南采集的健康煙草的根、莖、葉中共分離得到內生真菌62株，發現不同的組織中內生真菌的種群數量存在差異性。其中，從葉部分離29株，占菌株總數的46.8%；莖部分離24株，占菌株總數38.7%；根部分離9株，占菌株總數14.5%（圖1）。

通過形態觀察，結合分子生物學鑒定，將分離到的內生真菌鑒定為4目7科9屬。如表1所示，格孢菌目為優勢菌群，占分離總菌株數的61.3%。在屬水平上，莖點霉屬Phoma和鐮刀菌屬Fusarium為優勢屬，分離率分別為32.3%和29.0%。其在不同的組織中存在專化性。葉部Fusarium和Phoma為優勢屬；莖部優勢屬也為Fusarium和Phoma；根部Phoma為優勢屬。附球菌屬Epicoccum、小球腔菌屬Leptosphaeria以及毛霉屬Mucor只分布于葉中（圖1）。由此可見，煙草內生真菌具有豐富的多樣性，其種群結構和數量分布具有一定的組織偏好性和組織專化性。

2.2細胞毒活性測試結果

對分離獲得的20株不同種屬的內生真菌進行細胞毒活性測試。為充分發掘其活性潛力，獲得高活性發酵產物，采用液態培養基（PDB培養基）和固體培養基（大米培養基）兩種培養方式。其中菌株TE-1S、TE-6L、TE-14L的PDB發酵粗提物，TE-6L、TE-8L、TE-20R的大米發酵粗提物在48 h內的IC50＜40 μg/mL（表2）。其對人肝癌HepG2細胞的抑制率也呈濃度-時間依賴性，但具有抑制效果的菌株數量較少，且48 h內IC50均高于40 μg/mL（表2）。以上研究表明，煙草內生真菌的發酵產物具有一定程度的細胞毒活性，特別是對人腎癌Caki-1細胞表現出更加顯著的活性，且大米發酵物的抑制效果明顯優于PDB發酵液，表明固體培養基更有利于細胞毒活性代謝產物的生成。

2.3活性菌株的形態鑒定

在上述細胞毒活性篩選中，發現一株來源于葉部的菌株TE-6L，其PDB發酵液及大米發酵物對Caki-1均具有顯著的抑制活性，48 h內IC50分別為13.28和0.36 μg/mL，提示該菌株在不同培養條件下均有產細胞毒活性代謝產物的能力。該菌株在CYA、MEA和YES平板上為淡粉色菌落，菌絲體為絨毛狀，分生孢子為鐮刀狀（圖2），初步鑒定為鐮刀菌屬Fusarium真菌。利用通用引物ITS1和ITS4經PCR反應從該菌基因組DNA中擴增出長度為507 bp的單一DNA條帶，將該序列進行BLAST檢索，發現該菌株與接骨木鐮刀菌Fusariumsambucinum（序列號：KM231813.1）具有較高的同源性，其相似度為99%，因此將該菌株初步鑒定為F. sambucinum。該發現為發掘新型抗腫瘤先導藥物提供了新來源。

圖1不同屬的內生真菌在根莖葉中的分布及數量Fig. 1 Numbers and distribution of isolates of different genera

表1煙草內生真菌種群組成Table 1 The composition of endophytic fungi isolated fromN. tabacum

表2煙草內生真菌發酵產物對腎癌Caki-1細胞和肝癌HepG2細胞的IC50值Table 2 The IC50s of the crude extracts from the endophytic fungi inN. tabacumto Caki-1 and HepG2 cell lines μg/mL

圖2菌株TE-6L形態特征：(A)CYA平板；(B)MEA平板；(C)YES平板；(D-F)鐮刀狀分生孢子及有隔菌絲Fig. 2 Morphological characteristics of the fungal strain TE-6L. Colonies on agar media (A) CYA; (B) MEA; (C) YES; (D-F) Conidiophores and septahypha. Bar, 100 μm.

3 討 論

煙草中蘊含著豐富的內生真菌資源，同時，也有部分煙草內生細菌的報道，如彭細橋等[34]篩選獲得了對煙草青枯菌有拮抗作用的煙草內生細菌；雷麗萍等[35]發現煙草內生細菌具有還原硝酸鹽和亞硝酸鹽的能力。本研究通過對煙草內生真菌的分離和鑒定，發現煙草內生真菌的分布具有一定的組織偏好性，原因可能與根、莖、葉所處生態位不同有關。已有文獻證明，環境及生態因素是內生真菌分布差異的主要原因。李文君[36]發現煙草不同生長時期、不同部位及不同海拔樣地對煙草內生真菌的豐富度和多樣性均有影響。由于環境因素對內生真菌的分布具有重要影響，因此不同產區煙草內生真菌可能的地域專化性值得進一步探究。

植物內生真菌是一類活性代謝產物豐富、應用廣泛的潛在資源，目前已從青蒿[17]、水仙[29]、喜樹[37]、雷公藤[38]等分離篩選出了具有抗腫瘤活性的內生真菌，為新型抗腫瘤先導藥物的發現提供了新的途徑。煙草作為一種歷史悠久的藥用植物，其內生真菌抗腫瘤活性的研究尚未見報道。本研究首次對煙草內生真菌的代謝產物進行了細胞毒活性測試，為開發新型抗腫瘤藥物奠定基礎。

4 結 論

本研究從皖南采集的栽培種煙草分離得到內生真菌62株，鑒定為4目7科9屬，其中莖點霉屬Phomasp.和鐮刀菌屬Fusariumsp.為優勢屬。總結了煙草內生真菌在煙草不同組織中的分布規律及菌群變化，其種類和數量分布存在組織偏好性和組織專化性，葉部內生真菌的分離率最高，其次為莖，根部最少。發現了一株具有潛在應用價值的菌株F. sambucinumTE-6L，其PDB發酵液及大米發酵物對Caki-1細胞48 h內IC50分別為13.28和0.36 μg/mL。煙草中蘊含豐富的具有細胞毒活性的內生真菌資源，為進一步尋找抗腫瘤活性物質新來源、開發新型抗腫瘤藥物提供了新的途徑。

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The Biodiversity of Endophytic Fungi in NicotianaTabacum and Their Cytotoxicity

LI Panpan1,2, YUAN Xiaolong1, ZHENG Xuan1,2, GAO Lin1, LIU Xinmin1, ZHANG Zhongfeng1, ZHANG Peng1, SHEN Guoming1*
(1. Tobacco Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Qingdao 266101, China; 2. Graduate School of CAAS, Beijing 100081, China)

To investigate the biodiversity, distribution, and the microbial community structure of the endophytic fungi inNicotiana tabacum, the endophytic fungi in different cultispecies were systematically isolated and identified. The preliminary screening of the cytotoxic activities was also performed. As a result, a total of 62 strains of the endophytic fungi were isolated and purified from the healthy tissues (roots, stems, and leaves) of tobacco using the tissue isolation method. The isolated strains were identified to belong to 4 orders, 7 families, and 9 genera based on their morphological and molecular characteristics. More species and strains were isolated from the leaves, followed by the stems, and those in the roots were the least. The cytotoxicity of the crude extracts was determined by CCK-8 assay. The results indicated that most of the strains were found to have some inhibitory activities on Caki-1 and HepG2 cell lines. The IC50s of the strain TE-6L to Caki-1 at 24 h and 48 h were 13.28 and 0.36 μg/mL, respectively. Combined with morphological characteristics and molecular analysis, this strain was identified asFusarium sambucinum. The results from this study indicated that the tobacco possess abundant endophytic fungi, which provides a new path for searching for novel antitumor resources.

tobacco; endophytic fungi; community distribution; secondary metabolites; cytotoxicity

S476.12

1007-5119（2017）03-0074-06 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2017.03.013

中國農業科學院科技創新工程（ASTIP-TRIC05）；中國農業科學院煙草研究所青年科學基金項目“野生煙草Nicotianaalata化學成分多樣性及抗植物病原菌活性研究”（2016A02）

李盼盼（1990-），女，在讀碩士研究生，主要研究方向為植物內生真菌及其活性。E-mail：931449115@qq.com

*通信作者，E-mail：shenguoming@caas.cn

2016-09-12

2016-12-30