新輔助化療對乳腺癌細胞自噬及增殖影響的研究

王夫龍 巴金玲 張殿龍*

（遼寧省大連大學附屬中山醫院甲狀腺乳腺外科，遼寧 大連 116001）

WANG Fu-long, BA Jin-ling, ZHANG Dian-long

(Department of Thyroid and Breast Surgery, Aff i liated Zhongshan Hospital of Dalian University, Dalian 116001, China)

新輔助化療對乳腺癌細胞自噬及增殖影響的研究

王夫龍 巴金玲 張殿龍*

（遼寧省大連大學附屬中山醫院甲狀腺乳腺外科，遼寧 大連 116001）

目的 探討接受乳腺癌新輔助化療（NAC）前后，腫瘤組織中增殖性抗原67（Ki-67）和微管相關蛋白輕鏈3B（LC3B）的表達變化及臨床意義。方法 隨機選取我院2012年1月至2014年1月進行NAC治療的50例乳腺癌患者，采用免疫組化SP法分別檢測乳腺癌組織中的Ki-67和LC3B在NAC前后的表達水平。結果 Ki-67表達水平在NAC后降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；NAC后LC3B表達水平升高，具有統計學意義（P＜0.05），同時在新輔助化療后Ki-67和LC3B存在正相關性，具有統計學差異。結論 新輔助化療可影響Ki-67和LC3B的表達水平，反過來Ki-67和LC3B的表達狀態或許可影響NAC的療效，Ki-67和LC3B有可能成為NAC敏感性的預測指標。

新輔助化療；乳腺癌；Ki-67；LC3B

近年來，乳腺癌已成為女性常見的惡性腫瘤之一，是女性腫瘤死亡的主要原因之一。NAC作為乳腺癌綜合治療方法之一，在臨床中凸顯出越來越重要的作用。NAC主要在縮小腫瘤體積、增加保乳率等方面有顯著作用。而乳腺癌在化療后，會出現自噬耐藥現象，自噬發揮促進和抑制腫瘤雙重作用[1]。本實驗主要探討自噬蛋白LC3B和

Ki-67與乳腺癌NAC治療的關系以及LC3B和Ki-67在NAC治療前后的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料：隨機選擇我院2012年1月至2014年1月進行NAC治療的50例乳腺癌患者，均為女性；年齡29～68歲，平均（49.5±10.0）歲。所有病例均經乳腺病灶空心針穿刺活檢病理證實。NAC方案應用TAC方案（TXT75 mg/m2、EPI50 mg/m2、CTX 500 mg/m2）4個周期。化療4周期后評估療效，行手術治療，50例乳腺癌患者均行乳腺癌改良根治術。

1.2 實驗方法：采用免疫組化SP法分別檢測NAC前、后Ki-67和LC3B在乳腺癌組織中的表達水平，試劑購自美國Cell Signaling Technology公司。標本使用10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，連續4 μm切片，經二甲苯脫去石蠟，梯度酒精至水，3% H2O2消除內源性過氧化物酶。一抗4 ℃冰箱過夜后，逐步加入二抗、三抗室溫下溫育各15 min，每步驟以PBS沖洗。DAB顯色劑顯色后，蘇木素復染、脫水透明、封片。用PBS替代一抗作為陰性對照。

1.3 評定標準

1.3.1 療效評定：RECIST制訂的統一標準，測定乳腺癌患者化療前后腫塊大小的變化。采用彩超測量腫瘤最大直徑來判斷，分為：完全緩解（CR）、部分緩解（PR）、穩定（SD）、進展（PD），CR+PR+SD為臨床有效，PD為臨床無效，以乳房腫塊及腋淋巴結術后病理檢查無浸潤癌成分為病理完全緩解（pCR）。

1.3.2 免疫組化結果判斷標準：①Ki-67陽性物質呈棕黃色，定位于腫瘤細胞核；高倍鏡下共記數至少100個細胞，按腫瘤細胞中陽性比例計算百分率。表達強度＜14%為低表達，＞14%高表達。②LC3B定位于腫瘤細胞質中，陽性物質呈棕黃色或棕黃色顆粒。高倍鏡下共記數至少100個細胞，根據腫瘤細胞中陽性細胞的數量和染色程度綜合評判結果，a.著色細胞比例：0～4分分別為未著色；著色＜25%、25%～50%、50%～75%、75%～100%。b.著色強度：0～3分分別為未著色、淺黃色、中度、重度著色。c.著色比值+著色強度=總分：0～7分。0～1分為陰性；2～5分為陽性；6～7分記為強陽性。

1.4 統計學方法：采用SPSS23.0統計軟件進行統計學處理。采用卡方檢驗進行單因素的統計分析，兩個因素之間的相關性Spearman等級相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 乳腺癌組織中LC3B和Ki-67蛋白在NAC前后表達：療效分組中，50例乳腺癌患者行NAC前后Ki-67和LC3B蛋白表達水平變化，Ki-67蛋白表達水平＞14%下降，P值＜0.001具有顯著統計學意義，而LC3B表達水平強陽性由NAC前4%升高到92%，其變化具有顯著統計學意義（P＜0.001），見表1。

表1 新輔助化療前后Ki-67和LC3B表達水平變化

2.2 LC3B和Ki-67蛋白表達與新輔助化療療效之間關系：在新輔助化療前后，通過對同一患者臨床資料分析，進行臨床療效評價。50例患者中達到PR84%，SD16%，則臨床化療效果有效率100%，LC3B在臨床療效PR和SD中具有統計學差異（P=0.023＜0.05），Ki-67在臨床療效中也具有統計學意義（P=0.004＜0.05）。見表2。

表2 LC3B和Ki-67蛋白表達與化療效果之間關系

表3 LC3B和Ki-67之間的相關性

2.3 LC3B與Ki-67之間的相關性：通過對患者臨床資料的分析，在新輔助化療前50例患者LC3B陽性表達率為100%，LC3B與Ki-67存在相關性，但不具有統計學差異。在新輔助化療之后，LC3B與Ki-67表達組間經Fisher精確校正，P值為0.046，具有統計學差異。LC3B和Ki-67蛋白表達之間的相關性，經Spearman等級相關分析得出，等級相關系數RS=0.307，P＜0.05，由此說明，乳腺癌組織中LC3B與Ki-67的表達存在正相關相關關系，見表3。

3 討 論

NAC又稱術前化療，已成為乳腺癌綜合治療策略之一，和傳統輔助化療相比，減少原發腫瘤灶轉移，增加保乳手術機會。但據相關研究，NAC在增加保乳的同時，也可引起細胞產生自噬現象。

在自噬形成過程中，胞質內LC3B形成特有的環狀結構，并作為自噬體標記蛋白，據相關研究在三陰性乳腺癌中，LC3B表達高于其他類型乳腺癌[2]。另有研究，LC3B在尿道上皮惡性腫瘤中，表達水平低級別腫瘤低于高級別腫瘤，并與肌肉受侵襲有關，表明LC3B高表達與腫瘤高侵襲性相關[3]。另一蛋白Ki-67，G1期時開始表達，持續表達于G1、S、G2、及M期，不表達于細胞周期的靜止期（G0期）。通過檢測Ki-67蛋白表達，可反映腫瘤的增殖活性、發展及預測預后。

在新輔助療效的評價中，許多研究已經證實，乳腺癌中Ki-67高表達比低表達對NAC更加敏感，容易獲得較高pCR率，但高表達Ki-67與乳腺的惡性程度、淋巴轉移存在關聯，預后多不良[4]。Sullivan PS等研究報道，新輔助化療后 Ki-67表達降低可提高患者生存率，但Ki-67高表達者仍提示預后不良[5]。乳腺癌化療后自噬水平升高，在一定程度上說明新輔助化療誘導了細胞自噬，腫瘤細胞或許會通過自噬過程，來抵御化療對其自身的不良作用，甚至會產生細胞耐藥作用。據相關研究發現LC3B表達能力越高，腫瘤細胞增殖和侵襲能力越強，生存期縮短，預后越差[6]。在新輔助化療效果的分組中，臨床療效達到PR組LC3B的表達低于SD組LC3B的表達（P＜0.05）。或許也說明了原發腫瘤灶中LC3B高表達比低表達更容易獲得更好的化療效果。另一蛋白Ki-67高表達比低表達更容易在新輔助化療過程中獲益。

本實驗中，NAC前LC3B與Ki-67的表達具有相關性，但不具備統計學差異。但在NAC后存在正相關性（P＜0.05）。說明乳腺癌細胞高表達LC3B同時伴隨著高表達Ki-67，而高表達Ki-67乳腺癌細胞其增殖和自噬能力也較高，這或許提示自噬活性增加有助于乳腺癌細胞的增殖，發揮促進腫瘤細胞增殖、轉移的作用。

新輔助化療或許會影響LC3B和Ki-67的表達水平，而反過來LC3B和Ki-67的表達水平或許會影響新輔助化療效果。隨著研究地深入，LC3B作為自噬機制特殊標記蛋白，或許可以和Ki-67在腫瘤的預防、治療及預后過程中作為臨床指標，為臨床提供更多的參考依據。

[1] 陳靜瑤,李飛,余小平.乳腺癌化療抗性與自噬的關系研究進展[J].基礎醫學與臨床,2015,35(10):1393-1396.

[2] 徐曉恒.增殖細胞核抗原胞質表達對乳腺癌細胞自噬調控作用的研究[D].長春:吉林大學,2015.

[3] 石靜.LC3B和LC3C在乳腺癌中的表達及臨床意義[D].揚州:揚州大學,2014.

[4] Pohl G,Rudas M,Taucher S,et al.Expression of Cell Cycle Regulatory Proteins in Breast Carcinomas Before and After Preoperative Chemotherapy[J].Breast Cancer Res Treat,2003,78(1):97-103.

[5] Sullivan PS,Apple SK.Should histologic type be taken into account when considering neoadjuvant chemotherapy in breast carcinoma? [J].Breast J,2009,15(2):146-154.

[6] 萬華麗,張家玉.自噬在乳腺癌發生、發展中的機制和研究進展[J].海南醫學,2017,28(1):119-121.

The Effects of Neoadjuvant Chemotherapy on Autophagy and Proliferation Expression in Breast Cancer

Objective To discuss the expression and clinical significance of Ki-67 and Microtubule associated protein light chain LC3B (LC3B) in patients with breastcancer before and after neoadjuvant chemotherapy (NAC). Methods 50 patients with breast cancer who were treated by NACfrom January 2012 to January 2014 were randomly selected in the research. The immunohistochemical staining method was used to examine the expression levels of Ki-67 and LC3B in breast cancer tissues before and after NAC. Results The expression level of Ki-67 was decreased after NAC, the difference was statistically significant(P＜0.05), there was also statistical significance of LC3B changes after NAC (P＜0.05). Meanwhile there is a positive correlation between Ki-67 and LC3B after NAC, and statistically significant. Conclusion NAC may affect the expression levels of Ki-67 and LC3, and in turn the expression status of Ki-67 and LC3 may can affect the efficacy of NAC, Ki-67 and LC3 are likely to be predictive indicators of sensitivityto NAC.

Neoadjuvant chemotherapy; Breast cancer; Ki-67; LC3B

R737.9

B

1671-8194（2017）13-0015-02

WANG Fu-long, BA Jin-ling, ZHANG Dian-long

(Department of Thyroid and Breast Surgery, Aff i liated Zhongshan Hospital of Dalian University, Dalian 116001, China)

*通訊作者