雷公藤紅素聯合順鉑對舌鱗狀細胞癌Tca8113細胞作用機制的研究

賴河青

雷公藤紅素聯合順鉑對舌鱗狀細胞癌Tca8113細胞作用機制的研究

賴河青

目的探討雷公藤紅素聯合順鉑對舌鱗狀細胞癌Tca8113細胞作用機制。方法將Tca8113細胞分為對照組（0μmol/L順鉑和0μg/mL雷公藤紅素）、順鉑組（15μmol/L順鉑）、雷公藤紅素組（50μg/mL雷公藤紅素）以及聯合組（15μmol/L順鉑和50μg/mL雷公藤紅素），MTT法檢測細胞活力，酶聯免疫吸附法測定血管內皮生長因子（VEGF）、血管內皮生長因子-C（VEGF-C）、抗凋亡蛋白（Bcl-2）、凋亡蛋白（Bax）水平。結果順鉑組、雷公藤紅素組以及聯合組Tca8113細胞存活率分別為：（0.61±0.12）%、（0.59±0.12）%、（0.27±0.11）%，順鉑組、雷公藤紅素組Tca8113細胞存活率低于對照組的（1.00±0.00）%，差異有統計學意義（P＜0.05），聯合組Tca8113細胞存活率低于對照組、順鉑組與雷公藤紅素組，差異有統計學意義（P均＜0.05），雷公藤紅素組Tca8113細胞存活率低于順鉑組，但差異無統計學意義（P＞0.05）；順鉑組、雷公藤紅素組Tca8113細胞VEGF、VEGF-C、Bcl-2水平低于對照組[VEGF：（39.14±1.78）μmol/L、（41.11±1.45）μmol/L比（61.45±2.73）μmol/L，P＜0.05；VEGF-C：（43.11±1.37）μmol/L、（43.13±1.65）μmol/L比（61.33±2.16）μmol/L，P＜0.05；Bcl-2：（52.47±0.98）μmol/L、（53.47±1.03）μmol/L比（78.47±1.33）μmol/L，P＜0.05]，Bax水平高于對照組[（45.14±0.89）μmol/L、（44.14±1.12）μmol/L比（43.14±1.36）μmol/L，P＜0.05）]；聯合組VEGF、VEGFC、Bcl-2水平顯著低于對照組、順鉑組與雷公藤紅素組[VEGF：（23.1±2.13）μmol/L分別與（61.45± 2.73）μmol/L、（39.14±1.78）μmol/L和（41.11±1.45）μmol/L比較，P＜0.05；VEGF-C：（21.45±1.47）μmol/ L分別與（61.33±2.16）μmol/L、（43.11±1.37）μmol/L和（43.13±1.65）μmol/L比較，P＜0.05；Bcl-2：（36.47±1.25）μmol/L分別與（78.47±1.33）μmol/L、（52.47±0.98）μmol/L和（53.47±1.03）μmol/L比較，P＜0.05]；Bax水平高于對照組、順鉑組與雷公藤紅素組（79.14±1.45）μmol/L分別與（43.14±1.36）μmol/L、（45.14±0.89）μmol/L和（44.14±1.12）μmol/L比較，P＜0.05]；雷公藤紅素組VEGF、VEGF-C、Bcl-2、Bax水平與順鉑組相近，差異無統計學意義（P＞0.05）。結論雷公藤紅素聯合順鉑對舌鱗狀細胞癌Tca8113細胞作用優于順鉑和雷公藤紅素單獨作用，作用機制可能與其抑制VEGF、VEGFC、Bcl-2表達，促進Bax表達相關。

舌鱗狀細胞癌；Tca8113細胞；雷公藤紅素；順鉑

口腔鱗狀細胞癌（oral squamouscell carcinoma，OSCC）是常見的口腔頜面部惡性腫瘤，約占80%以上，以舌癌發病率最高，舌癌多數為鱗狀細胞癌[1]。舌鱗狀細胞癌Tca8113細胞能分泌放許多細胞促瘤因子,包括VEGF、VEGF-C等，其中VEGF、VEGF-C在調控腫瘤細胞的生長、增殖、凋亡方面起著至關重要的作用[2-3]。雷公藤紅素具有抗癌和抑制癌細胞增生的功能，與抑制腫瘤細胞VEGF、VEGF-C水平[4]，改變Bcl-2、Bax含量有關,而Bcl-2和Bax是對細胞凋亡起重要作用的調控蛋白[5]。順鉑廣泛用于各種頭頸部惡性腫瘤的治療，對口腔鱗癌的中度以上敏感率達到89%，其抗癌機制與Bcl-2、Bax相關[6]。近年來，越來越多的藥物被聯合使用來治療舌鱗狀細胞癌[7]。本研究擬觀察雷公藤紅素聯合順鉑對舌鱗狀細胞癌Tca8113細胞的影響，初步探討其抗癌機制。

1 材料與方法

1.1 研究對象人舌鱗狀癌細胞：Tca8113細胞株（中國科學院細胞庫，批號YY-XB-A00688）。

1.2 主要試劑及儀器雷公藤紅素（99.9%，CAS No：34157-83-0，Sigma公司）；順鉑（99.9%，國藥準字H37021358，齊魯制藥有限公司）；VEGF、VEGFC、Bcl-2、Bax Elisa試劑盒（南京森貝伽生物科技有限公司，批號KHG0111、RAB0513-1KT、RAB0757-1KT、CSB-E17114m）；RPMI-1640培養液（Thermo Scientific Forma公司，批號12633-012）；PBS液（武漢博士德公司）；二甲基亞砜（DMSO）（Sigma公司，批號0219605580）；0.25%含EDTA胰酶/胎牛血清（武漢普諾賽生命科技有限公司，批號SV30087.02）。倒置熒光顯微鏡EclipseE600（Nikon公司）；CO2細胞培養箱Thermo311（Thermo Scientific Forma公司）；恒溫培養箱grp-9080（通用公司）；超凈工作臺ECO 1.5（通用公司）；酶標儀HBS-1096A（通用公司）。

1.3 方法

1.3.1 試劑配制配制雷公藤紅素：2%胎牛血清的RPMI-1640完全培養液溶解雷公藤紅素母液，調整濃度為50μg/mL，NaHCO3及HCL調整pH至6.6，-20℃冰箱中進行保存。順鉑溶液常規配制。

1.3.2 細胞復蘇將裝有Tca8113細胞株的凍存管從液氮中取出，37℃水浴箱迅速解凍，無菌吸管吸取菌液至5mL EPP無菌管中，1500r/min，離心5min，上清液吸棄，加進pH值為7.2含10%胎牛血清、鏈霉素100μg/mL、青霉素100μg/mL的RPMI-1640培養基，直至5mL，37℃、5%CO2培養箱中進行培養傳代。

1.3.3 實驗分組預試驗順鉑組設2.4、6、15、37.5μmol/L 4個濃度梯度（1.5倍間距），時間梯度為24、48、72、96h；雷公藤紅素組設31.89、40、50、62.5μg/mL 4個濃度梯度（2.5倍間距），時間梯度為24、48、72、96h，根據預試驗結果確定正式試驗濃度（見表1）。正式試驗對照組設Tca8113細胞組（0μmol/L順鉑和0μg/mL雷公藤紅素）、順鉑組（15μmol/L順鉑）、雷公藤紅素組（50μg/mL雷公藤紅素）以及聯合組（15μmol/L順鉑和50μg/mL雷公藤紅素），各組細胞濃度分別為1×106個/mL。以上各組每孔設6個復孔，置于37℃、5%CO2培養箱中進行培養72h。

1.3.4 MTT法檢測細胞活力在染毒結束以后，每孔加MTT溶液（5mg/ml）10μL，37℃繼續孵育4h，吸棄孔內培養上清液。在每孔中加150μL的DMSO,經振蕩15min后結晶物充分溶解，利用酶標儀在490nm處波長測定吸光度（A）值，并計算細胞存活率：細胞存活率=（實驗組A值-空白組A值）（/對照組A值-空白組A值）×100%。

1.3 ．5VEGF、VEGF-C、Bcl-2、Bax測定染毒結束后，離心培養板收集其上清液，加入PBS制成細胞懸液后，酶聯免疫吸附法測定培養液VEGF、VEGF-C、Bcl-2、Bax含量。

1.4 統計學方法Excell 2010、SPSS19.0對數據進行錄入、統計分析。VEGF、VEGF-C、Bcl-2、Bax的含量以均數±標準差（x±s） 表示，分析前進行方差齊性及正態檢驗，若滿足正態及方差齊性，采用LSD兩兩方差分析，若不滿足正態及方差齊性，數據轉換后再進行LSD兩兩方差分析，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 不同濃度順鉑、雷公藤紅素在不同時間點對Tca8113細胞存活率的影響當順鉑濃度為15μmol/ L，作用時間為72h時，Tca8113細胞OD值最低；當雷公藤紅素濃度為50μg/mL，作用時間為72h時，Tca8113細胞OD值最低；當順鉑、雷公藤紅素濃度繼續增加，Tca8113細胞OD繼續降低。見表1。

表1 不同濃度順鉑、雷公藤紅素在不同時間點對Tca8113細胞存活率的影響（x±s）

2.2 順鉑、雷公藤紅素對Tca8113細胞存活率的影響聯合組、順鉑組、雷公藤紅素組Tca8113細胞的存活率明顯低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；聯合組存活率低于順鉑組與雷公藤紅素組，差異有統計學意義（P＜0.05）；雷公藤紅素組存活率低于順鉑組，但差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 順鉑、雷公藤紅素對Tca8113細胞存活率的影響（x±s）

2.3 順鉑、雷公藤紅素對VEGF、VEGF-C、Bcl-2、Bax水平的影響聯合組、順鉑組、雷公藤紅素組Tca8113細胞VEGF、VEGF-C、Bcl-2水平低于對照組（P均＜0.05），Bax水平高于對照組（P均＜0.05）；聯合組VEGF、VEGF-C、Bcl-2低于順鉑組與雷公藤紅素組（P均＜0.05），Bax高于順鉑組與雷公藤紅素組（P均＜0.05）；雷公藤紅素組VEGF、VEGF-C、Bcl-2、Bax水平與順鉑組相近，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

3 討論

OSCC往往引起組織或器官的殘缺，對正常的生理功能及外形產生了非常嚴重地影響，危及患者生命[8]。因此，對OSCC的研究具有特別重要的意義。研究[9]表明，在多種致瘤因素的共同影響下，正常的組織細胞出現了異常增生，從而形成腫瘤，腫瘤的增殖需要依靠腫瘤外間質組織的支持。許多研究[10]表明，在腫瘤生長過程中，會“激活”其周圍的間質，由此就出現了腫瘤的相關間質，反過來它又促進腫瘤的發生與進展。Tca8113細胞能分泌VEGF-C因子和VEGF因子，進而促進腫瘤細胞的生長、增殖以及腫瘤血管和淋巴管形成，從而促進口腔癌的的發展[11]。

研究[12-13]發現，Bcl-2家族蛋白在程序性細胞死亡中起重要作用，Bcl-2基因抑制細胞凋亡，延長細胞的生存而參與腫瘤的發生。Bcl-2蛋白主要分布在線粒體外膜、核膜等處，存在于造血細胞及多種腫瘤細胞中。在Bcl-2轉基因小鼠[14]（Transgenic Mice）可發現細胞凋亡（Apoptosis）減少，免疫細胞存活延長從而增加患膿毒癥時的生存率。體外實驗[15-18]均表明，Bcl-2基因可抑制多種刺激下多種細胞的凋亡。Bcl-2的過度表達可防止射線、糖皮質激素等引起的造血細胞凋亡（Apoptosis），同時也可防止病毒感染后的神經元凋亡。目前認為Bcl-2抗凋亡的機制主要有：（1）阻止細胞色素C激活Caspase；（2）抑制促凋亡蛋白質細胞色素C自線粒體釋放到胞質內；（3）對抗促凋亡基因Bax；（4）有抗氧化等作用[17]。

編碼的Bax蛋白能與Bcl-2組成異二聚體，對Bcl-2產生抑制作用[18]。研究[19]發現，當Bax表達量較高的時候，能促進細胞凋亡，Bcl-2表達量較高則抑制細胞凋亡，對腫瘤凋亡的發生有重要意義。所以，Bax是非常重要的促細胞凋亡（Apoptosis）基因之一。

表3 順鉑、雷公藤紅素對VEGF、VEGF-C、Bcl-2、Bax水平的影響（μmol/L，x±s）

本研究結果發現，單獨的順鉑組和雷公藤紅素組對Tca8113細胞的作用機制相似，均是抑制VEGF、VEGF-C、Bcl-2的表達，并促進Bax的表達。而在聯合組，順鉑和雷公藤紅素發生了協同作用，各指標的表達水平均要優于順鉑和雷公藤紅素單獨作用。

綜上所述，雷公藤紅素聯合順鉑對舌鱗狀細胞癌Tca8113細胞的作用優于順鉑和雷公藤紅素單獨作用，作用機制可能與其抑制VEGF、VEGF-C、Bcl-2的表達，促進Bax的表達相關。

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（收稿：2016-12-16修回：2017-01-20）

Effect of Combination of Tripterine and Cisplatin on Oral Squamous Cell Carcinoma Tca8113 Cells

LAI Heqing.
VIP Ward,Hangzhou Dental Hospital,Hangzhou(310006),China

ObjectiveTo investigate the effect of combination of tripterine and cisplatin on oral squamous cell carcinoma.MethodsTca8113 cells were divided into four groups:control group（0μmol/L cisplatin and 0μg/mL tripterine）,cisplatin group（15μmol/L cisplatin）,tripterine group（50μg/mL tripterine）and combined group（15μmol/L cisplatin and 50μg/mL tripterine）.MTT assay was used to assess cell activity,then ELISA assay was used to detect the protein level of vascular endothelial growth factor（VEGF）,VEGF-C,Bcl-2 and Bax.ResultsThe survival rates of cisplatin group,tripterine group and combination group were 0.61±0.12,0.59±0.12,and 0.27±0.11;the viability of Tca8113 cells in cisplatin group,tripterine group and combined group was significantly lower than that of control group（1.00±0.00,P＜0.05）;the viability in combined group was lower than those in cisplatin group andtripterine group,with a statistical difference（P＜0.05）;no significant difference was found between tripterine group and cisplatin group（P＞0.05）.VEGF,VEGF-C and Bcl-2 protein levels on Tca8113 cells in cisplatin group（39.14±1.78μmol/L,43.11±1.37μmol/L,52.47±0.98μmol/L）,tripterine group（41.11±1.45μmol/L,43.13±1.65μmol/L, 53.47±1.03μmol/L）,and combined group（23.1±2.13μmol/L,21.45±1.47μmol/L,36.47±1.25μmol/L）were lower than those in control group（61.45±2.73μmol/L,61.33±2.16μmol/L,78.47±1.33μmol/L）,but the Bax level in cisplatin group（45.14±0.89μmol/L）,tripterine group（44.14±1.12μmol/L）,and combined group（79.14±1.45）was higher than that in control group（43.14±1.36μmol/L）,with significant differences（P＜0.05）;significant differences were noted between combined group and cisplatin and tripterine groups;but the levels of VEGF,VEGF-C,Bcl-2 and Bax were similar between cisplatin group and tripterine group（P＞0.05）.ConclusionThe combination of tripterine and cisplatin has better curative effects on oral squamous cell carcinoma Tca8113 cells than using these two separately. The underlying mechanism of action may inhibit the expression of VEGF,VEGF-C and Bcl-2,meanwhile promote Bax.

oral squamous cell carcinoma;Tca8113 cell;tripterine;cisplatin

杭州口腔醫院總院17樓特需科（杭州310006）