經(jīng)皮芒硝超聲導(dǎo)入對重癥急性胰腺炎模型大鼠胰腺及相關(guān)性腹水的影響

楊偉剛 王志兵 金佳佳 陸周翔 陳建華

·論著·

經(jīng)皮芒硝超聲導(dǎo)入對重癥急性胰腺炎模型大鼠胰腺及相關(guān)性腹水的影響

楊偉剛 王志兵 金佳佳 陸周翔 陳建華

目的觀察經(jīng)皮芒硝超聲導(dǎo)入對急性胰腺炎（SAP）模型大鼠胰腺及相關(guān)性腹水（PAAF）的影響。方法將60只雄性SD大鼠隨機分為SAP對照組、芒硝外敷組、超聲導(dǎo)入組，每組20只。采用胰膽管逆行注入5%牛磺膽酸鈉的方法制備重癥急性胰腺炎（SAP）模型。72h后處死，檢測各組大鼠腹水量、血清腫瘤壞死因子α（TNF-α）、腹水淀粉酶（AMY）變化，對胰腺組織進行病理學(xué)檢查。結(jié)果芒硝外敷組及超聲導(dǎo)入組腹水量、血清TNF-α、腹水AMY等均顯著低于SAP對照組[腹水量：（11.7±1.0）g、（7.9±1.5）g比（16.3±2.4）g，P＜0.05或P＜0.01；TNF-α：（93.38±11.27）ng/L、（56.15± 17.30）ng/L比（120.46±20.16）ng/L，P＜0.05或P＜0.01；AMY:（13 296.0±428.2）U/L、（7236.0±578.6）U/L比（17 548.0±537.6）U/L，P＜0.05或P＜0.01]，芒硝外敷組及超聲導(dǎo)入組病理評分均顯著低于對照組[（7.6±0.6）分、（5.2±1.2）分比（9.8±0.5）分，P＜0.05或P＜0.01]，提示芒硝外敷組及超聲導(dǎo)入組較對照組胰腺組織炎癥、水腫、出血、壞死程度減輕，其中超聲導(dǎo)入組改善更優(yōu)于芒硝外敷組（P＜0.05）。結(jié)論芒硝外敷能改善SAP模型大鼠的炎癥和PAAF，經(jīng)皮芒硝超聲導(dǎo)入法療效優(yōu)于傳統(tǒng)芒硝外敷。關(guān)鍵詞大鼠；急性胰腺炎；腹水；動物模型；芒硝；超聲導(dǎo)入；TNF-α

重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）時可產(chǎn)生大量胰腺炎相關(guān)性腹水（pancreatitis associated ascitic fluid，PAAF），腹水中含有大量的胰酶、炎癥介質(zhì)、內(nèi)毒素等有害成分，能促進病情的發(fā)展，是影響SAP預(yù)后的重要因素[1]。因此，減少和控制PAAF對緩解病情的發(fā)展有積極的治療作用。臨床常用芒硝外敷治療胰腺水腫和腹腔滲液，研究[2]證實，芒硝外敷有消炎止痛，預(yù)防感染，吸收腹腔滲液，促進膿腫吸收等功效。近年研究[3]證實，采用超聲透皮給藥，可以增強包括大分子藥物在內(nèi)的許多藥物的透皮傳輸。本研究旨在利用經(jīng)皮芒硝超聲導(dǎo)入法，觀察芒硝對PAAF及炎癥的影響。

1 實驗材料

1.1 實驗動物清潔級雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量180～220g，浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供，動物許可證號：X1402263。飼養(yǎng)溫度20～23℃，環(huán)境濕度50%。

1.2 藥品與試劑芒硝，由湖州市中醫(yī)院中藥房提供。牛磺膽酸鈉（美國Sigma公司），TNF-αELISA試劑盒（購自武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司，批號L130813345）。

1.3 儀器高速離心機（上海精密器材廠）；酶標(biāo)儀（美國SUNRISE公司）；邁瑞B(yǎng)S-300全自動生化分析儀（深圳邁瑞公司）；超聲中頻導(dǎo)藥儀（沈陽市美辰醫(yī)療器械有限公司，型號MCTD-01型）。

2 實驗方法

2.1 分組與造模按隨機數(shù)字表法將60只大鼠隨機分成對照組、外敷組（傳統(tǒng)芒硝外敷）和超聲導(dǎo)入組（經(jīng)皮芒硝超聲導(dǎo)入），各20只。全部大鼠禁食不禁水12h，3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,取上腹部正中切口進腹后順胃逐步找到開口于十二指腸起始部的胰膽管，用針頭自開口根部逆行緩慢注射5%牛磺膽酸鈉（0.10mL/100g）采用微量泵恒速注入，注射結(jié)束用微血管夾鉗閉胰膽管，15min后取出微血管夾關(guān)腹。

2.2 給藥方法造模后，各組按20mL/（kg·d）皮下注射平衡液以支持，各組大鼠均以紗布袋敷于大鼠腹部,用束帶在大鼠背部捆綁,并在芒硝袋四角用絲線固定于大鼠腹部皮膚上各1針，外敷組、超聲導(dǎo)入組袋中裝有30g芒硝，對照組袋中裝有同樣重量鋁片；超聲導(dǎo)入組大鼠不間斷超聲導(dǎo)入芒硝，每12h更換芒硝1次。

2.3 檢測指標(biāo)及方法

2.3.1 腹水量和腹水淀粉酶（amylase，AMY）檢測72h后全部大鼠予以處死，于腹部行“U”型剖腹切口，開腹后用已稱重的滅菌干棉球吸盡腹腔腹水，再次稱重，兩次重量差即為腹水量；腹水稱重后送本院檢驗科由邁瑞B(yǎng)S-300全自動生化分析儀測定腹水AMY。

2.3.2 血清TNF-α檢測于腹主動脈取血3mL，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）方法測定，按試劑盒說明書進行操作。

2.3.3 胰腺病理學(xué)檢測及評分取大鼠完整胰腺組織，以4℃0.9%氯化鈉洗凈胰腺組織，觀察大鼠胰腺大體變化。沿主胰管軸剖開胰腺，切取胰腺標(biāo)本放入10%甲醛固定液中，制成石蠟切片，HE染色，盲法對大鼠胰腺組織切片行病理學(xué)檢查，按Schmidt等[4]標(biāo)準(zhǔn)進行評分，根據(jù)胰腺炎改變的主要特點，水腫、壞死、出血、炎性細胞浸潤等四項評分相加為每張切片的病理評分結(jié)果，評分越高，胰腺組織病理改變越嚴重。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量數(shù)據(jù)以（x±s） 表示，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 各組SAP大鼠腹水量比較各組大鼠腹腔內(nèi)均可見重量不等的腹水，SAP對照組可見血性腹水。與SAP對照組比較，芒硝外敷組及超聲導(dǎo)入組腹水量明顯減少（P＜0.05，P＜0.01），超聲導(dǎo)入組大鼠腹水量低于芒硝外敷組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組重癥急性胰腺炎模型大鼠腹水量比較（g，x±s）

3.2 各組SAP大鼠血清TNF-α和腹水AMY比較與SAP對照組比較，芒硝外敷組及超聲導(dǎo)入組大鼠血清TNF-α和腹水AMY水平均明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）；超聲導(dǎo)入組大鼠血清TNF-α和腹水AMY均低于芒硝外敷組（P＜0.05）。見表2。

3.3 各組SAP大鼠胰腺組織病理觀察SAP對照組胰腺小葉及腺泡高度水腫，腺泡小葉結(jié)構(gòu)片狀壞死，胰腺組織可見明顯出血。芒硝外敷組和超聲導(dǎo)入

表2 各組重癥急性胰腺炎模型大鼠血清TNF-α和腹水AMY比較（x±s）

S組胰腺小葉及腺泡水腫較輕，腺泡小葉結(jié)構(gòu)壞死面積減少，炎性細胞浸潤程度也顯著減輕。超聲導(dǎo)入組與芒硝外敷組相比，效果更顯著。見圖1（封二）。

3.4 各組SAP大鼠胰腺組織病理評分比較與SAP對照組比較，芒硝外敷組及超聲導(dǎo)入組大鼠胰腺組織病理評分均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；超聲導(dǎo)入組病理評分明顯低于芒硝外敷組（P＜0.05）。見表3。

表3 各組SAP大鼠胰腺組織病理學(xué)評分比較（分，x±s）

4 討論

SAP時由于胰管壓力增高，炎癥介質(zhì)的“級聯(lián)瀑布效應(yīng)”致使PAAF迅速出現(xiàn),PAAF中含有大量的胰酶、炎癥介質(zhì)和內(nèi)毒素等有害成分經(jīng)腹膜吸收進入體循環(huán)，是導(dǎo)致SIRS和MODS的重要原因[5]。因此，早期干預(yù)和控制PAAF對緩解病情的發(fā)展有重要意義。近年來，臨床上常采用腹腔灌洗、手術(shù)引流及B超引導(dǎo)下穿刺引流等方法減少腹水及毒性物質(zhì)的吸收已取得良好的療效，但均為有創(chuàng)操作，增加了感染、胰瘺等風(fēng)險。臨床上，芒硝外敷常被廣泛用于治療腹腔積液，作為中醫(yī)“內(nèi)病外治法”對急性胰腺炎也有很好輔助治療效果。

中醫(yī)認為，芒硝苦能瀉熱，咸能軟堅，其性善消,為“熱淫于內(nèi),治以咸寒”的代表藥,具有內(nèi)服泄熱通便、軟堅散結(jié),外用消炎、滲濕之功[6]。芒硝為含水硫酸鈉的天然礦物經(jīng)精制而成的結(jié)晶體，外敷能吸附腹部水分及炎性遞質(zhì)，使腹腔滲液吸收加快，防止腹膜炎，促進腸蠕動，防治腸麻痹，減少胰腺繼發(fā)感染的作用[7]。然而傳統(tǒng)的外敷給藥方式，由于皮膚角質(zhì)層的屏障作用，對于藥物的吸收效率較低，影響治療效果。臨床上已采用超聲藥物導(dǎo)入法來提高外用藥物的滲透作用，主要機制是利用超聲的空化作用，通過改變角質(zhì)層角化細胞排列結(jié)構(gòu)來提高皮膚滲透能力[8]。本研究中芒硝外敷組腹水量明顯少于SAP對照組，證實芒硝對腹水的緩解作用，同時超聲導(dǎo)入組腹水量低于芒硝外敷組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），胰腺組織病理評分更低，說明超聲導(dǎo)入法療效優(yōu)于單純芒硝外敷。

在急性胰腺炎病情進展中，腹水中胰酶和炎癥介質(zhì)發(fā)揮著重要作用。研究[9-11]表明，PAAF能激發(fā)細胞產(chǎn)生TNF-α,可以升高至血清濃度的3～16倍。大量釋放的TNF-α可直接導(dǎo)致胰腺腺泡細胞壞死，同時也是SIRS的始動因子，刺激其他炎癥介質(zhì)如IL-1、IL-6等的釋放，對胰腺造成“二次打擊”。因此，血清TNF-α水平可反應(yīng)胰腺組織的炎癥損害程度。胰酶是發(fā)生SAP最直接的因素，不僅可以破壞胰腺自身組織,還可滲出至胰腺周圍和腹腔損傷腹腔內(nèi)臟器，尤其可以使脂肪組織壞死液化。所以，相比血清AMY，采用腹水AMY水平更能反映胰腺的炎癥程度。本實驗中SAP對照組血清TNF-α和腹水AMY水平均明顯高于外敷及超聲導(dǎo)入組，其相應(yīng)的胰腺組織病理評分也明顯高于另兩組，也證實了上述觀點；同時通過比較發(fā)現(xiàn)超聲導(dǎo)入組血清TNF-α和腹水AMY水平低于芒硝外敷組，前者病理評分更低（P＜0.05），可見芒硝超聲導(dǎo)入療效優(yōu)于傳統(tǒng)外敷組。

綜上所述，運用中醫(yī)“內(nèi)病外治”理論結(jié)合現(xiàn)代超聲給藥方式，經(jīng)皮芒硝超聲導(dǎo)入法，對大鼠SAP模型及PAAF的療效優(yōu)于傳統(tǒng)芒硝外敷，安全有效，方法簡便，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

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（收稿：2016-12-16修回：2017-01-10）

Influence of Phonophoresis of Mirabilite on Pancreatitis Associated Ascitic Fluid in Rats

YANG Weigang, WANG Zhibing,JIN Jiajia,LU Zhouxiang,CHEN Jianhua.
Department of General Surgery,Huzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine,Huzhou(313000),China

ObjectiveTo investigate the influence of sonophoresis of mirabilite on pancreatitis associated ascitic fluid（PAAF）in rats.MethodsSixty male SD rats were randomly divided into control group,mirabilite-external application group and mirabilite-phonophonesis group（20 rats in each group）.The rat model of severe acute pancreatitis（SAP）was established by injecting 5%sodium taurocholate retrogradely into the biliary-pancreatic duct. The rats were killed after 72-h treatment.The volume of ascetic fluid,the level of serum TNF-α and ascites amylase（AMY）were detected,the pathological examination of pancreatic tissue samples was performed.Results The ascitic amount,serum TNF-α and ascitic AMY in mirabilite-external application group and mirabilite-phonophonesis group were significantly lower than those in control group（ascitic amount:11.7±1.0g and 7.9±1.5g vs 16.3±2.4g;TNF-α:93.38±11.27ng/L and 56.15±17.30ng/L vs 120.46±20.16ng/L;AMY:13296.0±428.2U/L and 7236.0±578.6U/L vs 17548.0±537.6U/L;all P＜0.05 or P＜0.01）.The pathological score in mirabilite-external application group and mirabilite-phonophonesis group were significantly lower than that in control group（7.6±0.6 and 5.2±1.2 vs 9.8±0.5,P＜0.05 or P＜0.01）.The pathological examination results showed milder inflammation of pancreatic tissue,edema,hemorrhage,and necrosis in both mirabilite groups compared with that in control group,pathological injury seemed obviously decreased in phonophonesis group.ConclusionPhonophoresis of mirabilite can improve the therapeutic effect of mirabilite for PAAF and more effectively alleviate inflammation of pancreas than a simpler method,indicating this method has preciser curative effect on SAP in rats.

rats;acute pancreatitis;ascetic fluid;animal model;mirabilite;phonophoresis;TNF-α

浙江省中醫(yī)藥科技計劃項目（No.2013ZB125）

浙江省湖州市中醫(yī)院普外科（湖州313000）

陳建華，Tel：13757288951；E-mail：865012567@qq.com