新疆一枝蒿藥材人工種植品種與野生品種的差異性分析Δ

蔡曉翠，顧政一，賀金華，張瑞萍，毛 艷，康雨彤（.新疆維吾爾自治區藥物研究所，烏魯木齊 830004；.天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室/中國醫學科學院北京協和醫學院藥物研究所，北京 00050）

新疆一枝蒿藥材人工種植品種與野生品種的差異性分析Δ

蔡曉翠1＊，顧政一1#，賀金華1，張瑞萍2，毛 艷1，康雨彤1（1.新疆維吾爾自治區藥物研究所，烏魯木齊 830004；2.天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室/中國醫學科學院北京協和醫學院藥物研究所，北京 100050）

目的：比較新疆一枝蒿藥材人工種植品種與野生品種藥材之間的差異性，篩選兩者之間的差異性組分。方法：采用高效液相色譜-質譜聯用法（HPLC-MS）建立22批不同產地及采摘時間的新疆一枝蒿人工種植品種與野生品種藥材的指紋圖譜，采用Marker ViewTM軟件、SIMCA-P 11.5軟件進行主成分分析，分析人工種植及野生一枝蒿主成分特點，篩選差異變量，獲得人工種植品種與野生品種的差異組分。結果：建立了22批一枝蒿（12批野生品種，10批人工種植品種）的指紋圖譜，經主成分分析，人工種植品種與野生品種分組良好，有明顯差異；不同采摘時間的人工種植品種主成分存在一定差異性，主要體現在開花前后，其中花蕾期、盛花期較集中；不同產地的野生品種植株有明顯的地域差異，在組分和含量上均有一定差異性；通過正離子模式的矩陣發現了268個變量，負離子模式發現了155個變量，經差異變量提取共找出28組變量，確定出19個變量。結論：人工種植品種與野生品種一枝蒿的主成分有明顯差異，主要體現在花期與采摘地等方面，可為新疆一枝蒿藥材的規范化種植、原產地保護等提供理論依據。

一枝蒿；主成分分析；人工種植；野生；差異變量；高效液相色譜-質譜聯用法

新疆一枝蒿（Artemisia rupestris L.）為菊科植物巖蒿（Artemisia brachyloba Franch）的地上部分或全草，主要分布在我國新疆，哈薩克斯坦、蒙古、俄羅斯、歐洲各國亦有分布。其維吾爾藥名為“一孜乎艾曼尼”，具有清熱退燒、消炎止痛、健胃消食、涼血解毒、活血化淤之功效，主治熱性或膽液質性或血液質性疾病，如熱性感冒、肝炎、胃疼、蕁麻疹等，對肝炎和感冒的療效尤為顯著[1-2]。文獻報道新疆一枝蒿全草含有黃酮類、倍半萜類、氨基酸、揮發油等多種成分，對于一枝蒿藥材的指紋圖譜及化學成分研究也已有報道[3]，但人工種植品種與野生品種之間成分是否存在差異未見報道。因此，在本研究中筆者基于主成分分析法（PCA）收集了22個不同產地不同采摘時間的一枝蒿藥材，運用高效液相色譜-質譜聯用法（HPLC-MS）對一枝蒿藥材進行多類別、多成分定性分析，確定人工種植藥材與野生藥材的差異性，為篩選、評價人工培育技術及工藝研究提供理論依據，為今后一枝蒿藥材的規范化種植、原產地保護等提供科學依據。

1 材料

1.1 儀器

QTRAP型四極桿-線性離子阱串聯質譜儀（美國Sciex公司）；1260系列HPLC儀，包括四元低壓梯度泵、光電二極管陣列檢測器、在線真空泵、柱溫箱、Chemstation型色譜工作站（美國Agilent公司）；BP211D型十萬分之一電子天平（德國Sartorius公司）。

1.2 試劑與藥材

一枝蒿酮酸對照品（中國醫學科學院新疆理化研究所，批號：111833-201105，純度：100%）；綠原酸（批號：110753-20041，純度：99.4%）、木犀草素（批號：11720-201106，純度：99.7%）、紫花牡荊素（批號：111554-200503，純度：98.9%）、芹菜素（批號：111901-201102，純度：99.2%）對照品均購于中國食品藥品檢定研究院；甲酸和甲醇為色譜純；水為純化水。一枝蒿藥材來源于新疆各地（人工種植的一枝蒿藥材均采自新疆維吾爾自治區烏魯木齊加斯特西部藥業有限公司種植基地），由新疆藥物研究所賀金華研究員鑒定為菊科蒿屬植物一枝蒿（Artemisia rupestris L.）。一枝蒿藥材來源信息見表1。

表1 一枝蒿藥材來源信息Tab 1 Source information of A.rupestris medicinal material

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent TC-C1（8250mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇（A）-0.2%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，92%B→70%B；5～25m in，70%B→40%B；25～40 min，40%B→20%B；40～45 min，20%B）；流速：1.0 m L/m in，柱后分流3∶1；柱溫：30；檢測波長：280 nm；進樣量：10μL。

2.2 質譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：多反應監測；離子源溫度：400；霧化氣壓力：60.00 psi（1 psi＝6.895 kPa）；輔助氣壓力：40.00 psi；掃描方式：全掃描監測（Q1 Scan）。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對照品貯備液 精密稱取綠原酸、木犀草素、一枝蒿酮酸、紫花牡荊素和芹菜素對照品適量，加甲醇分別制成質量濃度為2.62、0.593、5.00、1.192、1.219mg/m L的對照品貯備液，備用。

2.3.2 供試品溶液 稱取一枝蒿藥材粉末約2.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入50%甲醇溶液50m L，稱定質量，超聲（功率：250W，頻率：40 kHz）45m in，放冷，稱定質量，用50%甲醇溶液補足，搖勻，離心（離心半徑為5 cm，2 000 r/m in）5min，取上清液，即得。

2.4 指紋圖譜的建立

[4-7]的方法。稱取“1.2”項下22批一枝蒿藥材粉末，每份約2.5 g，精密稱定，按照“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件及“2.2”項質譜條件下分別于正離子檢測模式和負離子檢測模式下進樣測定，記錄色譜圖及各共有峰的峰面積，獲得22批樣品的指紋圖譜，詳見圖1（以20號樣品為例）。

圖1 一枝蒿的總離子流圖Fig 1 Total ion flow chromatogram of A.rupestris

2.5 主成分分析

2.5.1 人工種植與野生品種成分分析 采用HPLC-MS法分析22批一枝蒿樣本，得到正、負離子檢測模式的原始數據，將原始數據導入統計分析軟件Marker ViewTM中，以保留時間和質荷比（m/z）形成矩陣中每一列（變量）的標識，將樣品編號作為矩陣的行，獲得二維數據矩陣。將得到的二維數據矩陣輸入SIMCA-P 11.5軟件進行多變量統計分析。首先采用PCA行無監督的數據分析，觀察各組數據的聚類，結果無離群樣本；之后選用偏最小二乘判別分析（PLS-DA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）進行有監督的數據分析，并采用置換驗證防止模型過度擬合，結果正、負離子模式下人工栽培與野生品種均分組良好、無離群樣本點且存在明顯差異。22批藥材主成分分析結果見圖2（圖中t[1]、t[2]表示每個樣品在主成分1、2上投影的得分值，下同）。

圖2 22批藥材主成分分析結果Fig 2 Results of principal com ponent analysis of 22 batchesofm edicinalm aterials

2.5.2 人工種植品種成分分析 將人工種植品種的10個樣本一枝蒿藥材數據標準化后進行PCA分析，所得的PCA結果見圖3。

圖3 10批人工種植藥材主成分分析結果Fig 3 Results of principal com ponent analysis of 10 batches of artificially cu ltivated m edicinalmaterials

從圖3可以看出，不同采摘時間的人工種植新疆一枝蒿藥材成分存在一定差異性，主要體現在開花前后，其中花蕾期、盛花期差異較集中，這對指導人工種植品種的種植及采摘時間有重要意義。

2.5.3 野生品種成分分析 將野生品種的12個樣本一枝蒿藥材數據標準化后進行PCA分析，所得的PCA結果見圖4。

圖4 12批野生品種藥材主成分分析結果Fig 4 Results of principal com ponent analysis of 12 batchesofw ildmedicinalmaterials

從圖4可以看出，不同產地的野生品種植株，有5個產地植株的主成分分布比較集中，有明顯的地域差異，每個樣品點較為分散，說明各野生植株成分差別較大。

2.6 差異性分析

通過正交校正的OPLS-DA模型的樣品分散點載荷圖（S-plot）、特征值（VIP）、置信區間的載荷圖與原始變量輪廓圖進行篩選。首先，變量的VIP＞1.0被認為該變量對模型有較大影響，為關注差異明顯的變量，只選擇VIP＞1.0的變量；其次，通過置信區間的載荷圖進行可靠性驗證；此后，對篩選的變量采用原始變量輪廓圖進一步確認，刪除兩組數據嚴重重疊的變量。結果，通過正離子檢測模式獲得的HPLC-MS譜生成的矩陣中發現了268個變量，負離子檢測模式中發現了155個變量；采用Marker ViewTM軟件對差異變量行t檢驗，篩選出在兩組間具有明顯差異的變量；采用XCMSOnline軟件中CAMERA分析，刪除加合離子、同位素離子或碎片離子，確定顯著性差異組分。結果共找出28組變量，確定了19個變量，詳見表2。

表2 人工種植與野生品種一枝蒿藥材的變量Tab 2 Variables of artificially cultivated and w ild A. rupestris medicinalmaterial

3 討論

3.1 PCA法的優勢

PCA法是一種應用廣泛的化學計量學方法，可用于簡化數據、快速實現模式化關系的可視化識別，是綜合評價的主要手段之一，現已廣泛應用于中藥復雜體系的分析中。其利用降維思想，通過研究指標體系的內在結構關系[8-9]，在不損失或盡量少損失原有指標信息的情況下把多指標轉化成少數幾個互相獨立而且包含原有指標大部分信息（70%～85%）的綜合指標，可避免在綜合評價時主觀加權的弊端[10-11]。本研究采用HPLC-MS法結合PCA分析，對不同產地及不同采摘時間的種植品種與野生品種的新疆一枝蒿藥材成分進行了分析比較，能較全面地反映藥材樣本的信息。

3.2 野生品種比較

由試驗結果可知，不同產地的野生品種植株，有明顯的地域差異，在組分和含量上均有一定差異性（含量差異性將另文發表）；采摘時記錄結果顯示，不同產地的植株在形態上也有很大的差異。此差異性可能與產地的地理環境、氣候、光照時間、濕度、土壤酸堿度等有關。

3.3 人工種植品種不同采摘期比較

由試驗結果可知，不同采摘時間的人工種植新疆一枝蒿藥材存在一定差異性，不同時期的藥材主要成分含量變化明顯，此次實驗確定人工種植品種藥材的最佳采摘時間為花蕾期和花盛期。這一結果可用于指導一枝蒿藥材的人工種植及采摘，從而保證藥材的內在質量及臨床療效，并可替代野生藥材從而保護生態資源。

3.4 人工種植品種與野生品種差異性分析

一枝蒿在主成分空間中分為2個不同的區域，通過差異變量提取共找出28組變量，確定出19個變量，基本實現了人工種植品種與野生品種的區分，為藥材的規范化種植、原產地保護等提供了理論依據，為不同一枝蒿藥材的質量評價及資源的合理利用提供了依據。

參考文獻

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Analysis of the Differences between Artificially Cultivated and W ild Xinjiang Artem isia rupestris

CAIXiaocui1，GU Zhengyi1，HE Jinhua1，ZHANG Ruiping2，MAO Yan1，KANG Yutong1（1.The Xinjiang Institute of Materia Medica，Urumqi 830004，China；2.State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines/Institute of Materia Medica，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100050，China）

OBJECTIVE：To compare the differences between artificially cultivated and w ild Xinjiang Artemisia rupestris，and screen the different components.METHODS：HPLC-MSwas adopted to establish the fingerprints of artificially cultivated and w ild Xinjiang A.rupestris from different origin and harvest time.Principal component analysis was conducted by Marker ViewTMsoftware and SIMCA-P 11.5 software，the characteristics of principal components were analyzed，difference variable was screened，and different components of artificially cultivated and w ild varietieswere obtained.RESULTS：Fingerprints of 22 batches of A.rupestris（12 batches of w ild varieties，10 batches of artificially cultivated varieties）were established.According to the principal component analysis，artificially cultivated and w ild varieties were well grouped，w ith obvious differences；the principal components of artificially cultivated varieties w ith different harvest time showed certain difference，mainly before and after flowering，concentrating in to-be flowering and full flowering periods.Wild varieties from different origins had obvious regional difference，show ing certain differences in composition and content.268 variables were found in matrix of positive ionmode and 155 in negative ion mode. 28 groups of variables were extracted by difference variable，and 19 variables were determ ined.CONCLUSIONS：Artificially cultivated and w ild varieties have obvious difference in principal component，mainly in flowering period and picking places.It can provide theoretical basis for the standardized cultivation and origin protection of Xinjiang A.rupestris.

Artemisia rupestris；Principal component analysis；Artificially cultivation；Wild；Different variables；HPLC-MS

R931.2

A

1001-0408（2017）16-2224-04

2016-07-11

2017-03-30）

（編輯：劉明偉）

國家自然科學基金新疆聯合基金資助項目（No. U1303224）；新疆維吾爾自治區公益性科研院所基本科研業務經費資助項目（No.KY2015123）

＊助理研究員。研究方向：民族藥質量控制。電話：0991-2322941。E-mail：cxcmaro@sina.com

#通信作者：研究員，碩士。研究方向：民族藥研究與開發。電話：0991-2828537。E-mail：zhengyi087@126.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.16.17