尼美舒利聯合奧沙利鉑對食管癌大鼠移植瘤生長及免疫功能的影響

李 萌，何 勇，肖 飛，田遠耀（.安徽醫科大學附屬巢湖醫院藥劑科，安徽巢湖 38000；.池州市人民醫院藥劑科，安徽池州 47000）

尼美舒利聯合奧沙利鉑對食管癌大鼠移植瘤生長及免疫功能的影響

李 萌1＊，何 勇2，肖 飛1，田遠耀1（1.安徽醫科大學附屬巢湖醫院藥劑科，安徽巢湖 238000；2.池州市人民醫院藥劑科，安徽池州 247000）

目的：研究尼美舒利聯合奧沙利鉑對食管癌大鼠移植瘤生長及免疫功能的影響。方法：將大鼠隨機分為模型組（ig羧甲基纖維素鈉溶液+尾iv 5%的葡萄糖注射液）、尼美舒利組（ig 20mg/kg）、奧沙利鉑組（尾iv 13.6mg/kg）及聯用組，每組10只，ih食管癌Eca109細胞建立移植瘤模型。建模成功后各組大鼠按相應方式給予相應藥物，ig每天1次，尾iv每4 d 1次。8周后處死大鼠，測量各組大鼠瘤體積和瘤質量，計算抑瘤率，檢測血清中腫瘤標志物（CEA、CYFRA21-1、SCCAg）含量、外周血中免疫細胞（CD3+、CD4+、CD8+T細胞和NK細胞）百分比。結果：與模型組比較，其余3組大鼠瘤體積和瘤質量減小（P＜0.05）；腫瘤標志物含量減少（P＜0.05）；尼美舒利組大鼠CD3+、CD4+T細胞和NK細胞百分比增高，CD8+T細胞百分比降低（P＜0.05）；奧沙利鉑組和聯用組大鼠CD3+、CD4+T細胞和NK細胞百分比降低，CD8+T細胞數量百分比增高（P＜0.05）。與尼美舒利組和奧沙利鉑組比較，聯用組大鼠抑瘤率增加（P＜0.05），腫瘤標志物含量減少（P＜0.05），免疫細胞百分比較尼美舒利組降低、較奧沙利鉑組增高（P＜0.05）。結論：尼美舒利能增強奧沙利鉑對食管癌的抑瘤作用，降低奧沙利鉑對大鼠免疫功能的抑制程度。

食管癌；尼美舒利；奧沙利鉑；免疫功能；大鼠

食管癌是消化系統常見的惡性腫瘤之一，多數患者確診時已經發展至中晚期，需要通過靜脈化療來延緩病情發展、延長患者生存時間[1]。奧沙利鉑是臨床常用的食管癌化療藥物，對癌細胞具有殺傷效應，但是受到其胃腸道反應、神經毒性和骨髓移植等不良反應的影響，導致患者預后并不理想[2]。近年來關于消化道惡性腫瘤的研究證實，環氧合酶2（COX-2）與腫瘤的發生和發展密切相關，COX-2是催化花生四烯酸轉化為前列腺素的限速酶，其表達量升高能促進癌細胞的增殖、遷移和侵襲。尼美舒利是新型非甾體類抗炎藥物，能夠高選擇性抑制COX-2的活性[3]。因此，本文設計研究了尼美舒利聯合奧沙利鉑對食管癌大鼠移植瘤生長及免疫功能的影響，以期為提高奧沙利鉑的臨床療效提供參考。

1 材料

1.1 儀器

7600全自動生化分析儀（日本日立公司）；CytoFLEX流式細胞分析儀（美國貝克曼庫光特公司）；Heraeus Pico 21 Centrifuge離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 藥品與試劑

尼美舒利片（廣東惠德勒藥業有限公司，批號：153924681，規格：每片0.1 g）；奧沙利鉑甘露醇注射液（辰欣藥業股份有限公司，批號：152205678，規格：每100m L含奧沙利鉑50mg、甘露醇5.1 g）；DMEM培養基和胎牛血清（美國Promega公司）；癌胚抗原（CEA）、細胞角蛋白片段19（CYFRA21-1）、鱗狀上皮細胞癌相關抗原（SCCAg）試劑盒（瑞士Roche公司）；CD3+、CD4+、CD8+T細胞及NK細胞熒光素標記單克隆抗體（英國Abcam公司）。

1.3 細胞與動物

食管癌Eca109細胞購買于中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。清潔級SD大鼠40只，♂，4～5周齡，體質量160～200 g，購于揚州大學動物實驗中心，許可證號：SCXK（蘇）2015-0143，在恒溫（22～25）、恒濕（40%～60%）條件下飼養，本次研究報請醫院動物倫理委員會批準。

2 方法

2.1 細胞培養及移植瘤模型建立

Eca109細胞復蘇后采用含10%胎牛血清的DMEM培養基進行培養，擴增傳代后收集對數生長期細胞并調節細胞密度至1×107個/m L。取大鼠，于右側前肢腋下ih 0.5m L細胞懸液建立移植瘤模型，4 d后腫瘤體積約為100mm3表示建模成功。

2.2 分組與給藥

將建模成功的大鼠隨機分為模型組、尼美舒利組、奧沙利鉑組及聯用組，每組10只。尼美舒利組大鼠ig尼美舒利20mg/kg（用羧甲基纖維素鈉溶液溶解）；奧沙利鉑組大鼠尾iv奧沙利鉑13.6mg/kg（用5%的葡萄糖注射液1m L溶解）；聯用組大鼠同時ig尼美舒利20mg/kg和尾iv奧沙利鉑13.6mg/kg；模型組大鼠同時ig等劑量羧甲基纖維素鈉溶液和尾iv 5%的葡萄糖注射液1m L。ig每天1次，尾iv每4 d 1次，連續給藥8周。

2.3 腫瘤生長情況觀察

給藥8周后處死大鼠，測量腫瘤病灶的長徑以及與其垂直的短徑，計算瘤體積；同時稱瘤質量，計算抑瘤率，抑瘤率（%）＝（1－給藥組瘤質量/模型組瘤質量）× 100%。

2.4 血清中腫瘤標志物含量測定

給藥8周后處死大鼠，摘取眼球取血2m L，1 000×g離心15m in，收集血清置于－80冰箱中保存。采用酶聯免疫吸附法（ELISA），按相應試劑盒說明操作，檢測各組大鼠血清中腫瘤標志物CEA、CYFRA21-1、SCCAg的含量。

2.5 外周血中CD3+、CD4+、CD8+T細胞及NK細胞百分比檢測

給藥8周后處死大鼠，摘取眼球取血2m L，分離外周血單個核細胞，用冰生理鹽水清洗，4下300×g離心15m in，棄上清，向沉淀中分別加入5μL CD3+、CD4+、CD8+細胞及NK細胞熒光素標記單克隆抗體，吹打均勻，4孵育60m in。加入細胞洗液，混勻，300×g離心3 min，棄上清，用洗液洗3次；加入破膜液1m L，振蕩避光保存12min；加入1m L細胞洗液，300×g離心5min；加入各組對應的抗體20μL，避光孵育30m in；加入1m L細胞洗液，300×g離心5m in，棄去上清。加細胞洗液定容至0.5m L，將沉淀吹打均勻，然后用流式細胞儀測定被標記的CD3+、CD4+、CD8+T細胞及NK細胞的百分比。

2.6 統計學方法

3 結果

3.1 腫瘤生長情況

與模型組比較，其余3組大鼠瘤體積和瘤質量均減小（P＜0.05）。與尼美舒利組比較，奧沙利鉑組和聯用組大鼠瘤體積和瘤質量均減小（P＜0.05），抑瘤率均增加（P＜0.05）；其中聯用組瘤體積、瘤質量減小程度和抑瘤率增加程度均較奧沙利鉑組更明顯（P＜0.05）。各組大鼠腫瘤的生長情況見表1。

3.2 血清中腫瘤標志物含量

與模型組比較，其余3組大鼠血清中CEA、CYFRA21-1、SCCAg含量均減少（P＜0.05）。與尼美舒利組比較，奧沙利鉑組和聯用組大鼠血清中CEA、CYFRA21-1、SCCAg含量均減少（P＜0.05），其中聯用組減少程度較奧沙利鉑組更明顯（P＜0.05）。各組大鼠血清中腫瘤標志物的含量見表2。

表1 各組大鼠腫瘤的生長情況（±s，n＝10）Tab 1 Tumor grow th of rats in each group（±s，n＝10）

表1 各組大鼠腫瘤的生長情況（±s，n＝10）Tab 1 Tumor grow th of rats in each group（±s，n＝10）

注：與模型組比較，＊P＜0.05；與尼美舒利組比較，#P＜0.05；與奧沙利鉑組比較，ΔP＜0.05Note：vs.model group，＊P＜0.05；vs.nimesulide group，#P＜0.05；vs.oxaliplatin group，ΔP＜0.05

組別瘤體積，mm3瘤質量，g 抑瘤率，%

表2 各組大鼠血清中腫瘤標志物的含量（±s，n＝10）Tab 2 Contents of tumor markers in rat serum in each group（±s，n＝10）

表2 各組大鼠血清中腫瘤標志物的含量（±s，n＝10）Tab 2 Contents of tumor markers in rat serum in each group（±s，n＝10）

注：與模型組比較，＊P＜0.05；與尼美舒利組比較，#P＜0.05；與奧沙利鉑組比較，ΔP＜0.05Note：vs.model group，＊P＜0.05；vs.nimesulide group，#P＜0.05；vs.oxaliplatin group，ΔP＜0.05

SCCAg，μg/L 2.29±0.34 1.98±0.26＊1.27±0.19＊#0.52±0.08＊#Δ組別模型組尼美舒利組奧沙利鉑組聯用組CEA，μg/mL 7.05±0.92 6.30±0.74＊4.42±0.51＊#2.71±0.33＊#ΔCYFRA21-1，ng/mL 5.58±0.89 3.95±0.65＊3.59±0.57＊#2.05±0.36＊#Δ

3.3 外周血中免疫細胞百分比

與模型組比較，尼美舒利組大鼠外周血中CD3+、CD4+T細胞和NK細胞百分比增高，CD8+T細胞百分比降低（P＜0.05）；奧沙利鉑組和聯用組大鼠外周血中CD3+、CD4+T細胞和NK細胞百分比降低，CD8+T細胞百分比增高（P＜0.05）。與尼美舒利組比較，奧沙利鉑組和聯用組大鼠外周血中CD3+、CD4+T細胞和NK細胞百分比降低，CD8+T細胞百分比增高（P＜0.05），其中聯用組大鼠外周血中免疫細胞百分比介于尼美舒利組和奧沙利鉑組中間（P＜0.05）。各組大鼠外周血中免疫細胞的百分比見表3。

表3 各組大鼠外周血中免疫細胞的百分比（±s，n＝10，%%）Tab 3 Percentages of imm une cells in rat peripheral blood in each group（±s，n＝10，%%）

表3 各組大鼠外周血中免疫細胞的百分比（±s，n＝10，%%）Tab 3 Percentages of imm une cells in rat peripheral blood in each group（±s，n＝10，%%）

注：與模型組比較，＊P＜0.05；與尼美舒利組比較，#P＜0.05；與奧沙利鉑組比較，ΔP＜0.05Note：vs.modelgroup，＊P＜0.05；vs.nimesulide group，#P＜0.05；vs.oxaliplatin group，ΔP＜0.05

NK細胞12.54±1.25 15.32±1.36＊7.72±1.05＊#10.68±1.13＊#Δ組別模型組尼美舒利組奧沙利鉑組聯用組CD3+T細胞45.28±5.94 52.42±6.24＊30.42±4.25＊#40.56±7.12＊#ΔCD4+T細胞25.15±3.14 27.12±3.42＊16.15±1.42＊#21.36±2.68＊#ΔCD8+T細胞30.35±4.52 27.28±3.22＊38.10±4.12＊#34.52±3.35＊#Δ

4 討論

食管癌是一種總體生存率極低的惡性腫瘤，常采用聯合化療的方式來控制病情的發展[4-5]。鉑類藥物、伊立替康、紫杉醇、多西他賽、吉西他濱均被用于此疾病的治療[6]。近年來對于奧沙利鉑治療食道癌的報道很多[7-8]，因此本研究采取與尼美舒利聯用的方案來考察其對食道癌大鼠移植瘤生長及免疫功能的影響，選用尼美舒利作為聯合藥物旨在降低奧沙利鉑的不良反應。

近年來，關于消化道惡性腫瘤的研究證實，COX-2能夠通過合成前列腺素來調控癌細胞的生長、分化、侵襲、遷移以及血管新生，進而促進腫瘤病情的發展[9-10]。尼美舒利是新型非甾體類抗炎藥物，能夠高選擇性抑制COX-2的活性，主要成分為2-苯氧基甲基磺酰苯胺，口服后1～2 h能夠達到血漿濃度峰值，有效治療濃度持續時間為6～8 h，相對生物利用度高達95%左右[11]。動物實驗證明，尼美舒利能夠預防惡性腫瘤的發生，抑制腫瘤的發展、轉移與浸潤[11]。李佳等[12]的研究認為尼美舒利對胰腺癌PANC-1細胞的生長具有抑制作用，楊鳳玉等[13]的研究認為尼美舒利對宮頸癌HeLa細胞的凋亡具有促進作用。本研究發現，聯用組大鼠瘤體積和瘤質量均明顯低于尼美舒利組、奧沙利鉑組（P＜0.05），抑瘤率明顯高于尼美舒利組、奧沙利鉑組（P＜0.05），提示尼美舒利能增強奧沙利鉑對食管癌的抑瘤作用。

腫瘤標志物檢測是臨床上早期篩查惡性腫瘤以及判斷惡性腫瘤病情進展程度的常用方法，與食管癌相關的腫瘤標志物包括CEA、CYFRA21-1、SCCAg[14]。CEA是臨床篩查消化道惡性腫瘤最常用的標志物，CYFRA21-1是細胞角蛋白19的可溶性片段，SCCAg是鱗狀上皮細胞惡變過程中產生的糖蛋白，3種指標均能反映腫瘤負荷情況[15]。本研究中，聯用組大鼠血清中腫瘤標志物含量均明顯低于尼美舒利組、奧沙利鉑組（P＜0.05），提示尼美舒利能增強奧沙利鉑對食管癌的抑瘤作用，治療后血清中腫瘤標志物含量更低。

化療藥物會造成不同程度的免疫功能損傷，淋巴細胞T細胞亞群與NK細胞均是檢驗免疫功能的特異性與敏感性標志物[16]。本研究中，聯用組大鼠外周血中免疫細胞百分比介于尼美舒利組和奧沙利鉑組中間（P＜0.05），提示尼美舒利能降低奧沙利鉑治療后對大鼠免疫功能的抑制程度。

綜上所述，尼美舒利與奧沙利鉑聯用能抑制食管癌模型大鼠的腫瘤生長，其作用機制可能與降低腫瘤標志物含量、改善免疫功能有關，但由于本文只是一個實驗性動物研究，缺乏對血管內皮生長因子表達的比較，因此尼美舒利與奧沙利鉑聯用治療食管癌的臨床療效還有待于進一步研究。

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（編輯：鄒麗娟）

Effects of Nimesulide Combined w ith Oxaliplatin on Transplanted Tumor Grow th and Immune Function of Ratsw ith Esophageal Cancer

LI Meng1，HE Yong2，XIAO Fei1，TIAN Yuanyao1（1.Dept.of Pharmacy，Chaohu Hospital Affiliated to Anhui Medical University，Anhui Chaohu 238000，China；2.Dept.of Pharmacy，People’s Hospital of Chizhou City，Anhui Chizhou 247000，China）

Esophageal cancer；Nimesulide；Oxaliplatin；Immune function；Rats

relevantmedicines by corresponding ways，once a day for ig，once every 4 d for iv in tail.Rats were sacrificed after 8 weeks，tumor volume and quality of ratsweremeasured，tumor inhibition rate was calculated，and contents of tumormarkers（CEA，CYFRA21-1，SCCAg），percentages of immune cells（CD3+，CD4+，CD8+T cells and NK cell）in peripheral blood were detected.RESULTS：Compared w ith model group，tumor volume and quality in other 3 groups were decreased（P＜0.05）；contents of tumormarkers were decreased（P＜0.05）.Percentages of CD3+，CD4+T cells and NK cell in nimesulide group were increased，percentages of CD8+T cellwas decreased（P＜0.05）.Percentages of CD3+，CD4+T cells and NK cell in oxaliplatin group and combination group were decreased，percentages of CD8+T cell was increased（P＜0.05）.Compared w ith nimesulide group and oxaliplatin group，tumor inhibition rate in combination group was increased（P＜0.05）；contents of tumormarkers were decreased（P＜0.05）；percentages of immune cellswere lower than nimesulide group and higher than oxaliplatin group（P＜0.05）.CONCLUSIONS：Nimesulide can enhance the oxaliplatin’s antitumor effect on esophageal cancer，and decrease its inhibition degree on immune functions.

2016-09-02

2017-04-06）

＊主管藥師。研究方向：臨床藥學。電話：0551-82324114。E-mail：ahlemon@163.com

R965

A

1001-0408（2017）16-2208-04

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.16.13

ABSTRACTOBJECTIVE：To study the effects of nimesulide combined w ith oxaliplatin on transplanted tumor grow th and immune function of ratsw ith esophageal cancer.METHODS：Ratswere random ly divided intomodel group（intragastrically given Sodium carboxymethyl cellulose solution+intravenously given 5%Glucose injection in tail），nimesulide group（intragastrically given 20 mg/kg），oxaliplatin group（intravenously given 13.6 mg/kg in tail）and combination group，10 in each group.Esophageal cancer Eca109 cells were subcutaneously injected to develop transplanted tumormodel.A ftermodeling，rats in each group