不同抗肝纖維化方劑薄層色譜和髙效液相色譜保留時間分析

彭巧玲 韓子巖

山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院消化科 （山西太原，030001）

不同抗肝纖維化方劑薄層色譜和髙效液相色譜保留時間分析

彭巧玲 韓子巖△

山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院消化科 （山西太原，030001）

目的：對不同抗肝纖維化中藥方劑進(jìn)行成分性質(zhì)的初探。方法：應(yīng)用薄層色譜法和高效液相色譜法分析復(fù)方861、八味抗纖方、強肝膠囊、扶正化瘀膠囊、化肝纖沖劑、復(fù)方鱉甲軟肝片的脂溶性／水溶性及成分保留時間。結(jié)果：薄層色譜法顯示所有方劑水溶性成份顯著，僅扶正化瘀膠囊脂溶性成份顯著。高效液相色譜顯示復(fù)方861、八味抗纖方、強肝膠囊、扶正化瘀膠囊、化肝纖沖劑和復(fù)方鱉甲軟肝片的成分保留時間個數(shù)分別是45、37、43、45、25和31，其中相同的保留時間9個。結(jié)論：抗肝纖維化方劑以水溶成分為主，方劑成分幾十種，少部分重疊；中醫(yī)中藥在抗肝纖維化方面一病多方是可能的。

中藥方劑；肝纖維化；薄層色譜；高效液相色譜

中藥防治肝纖維化是我國的特色和優(yōu)勢。前期我們已經(jīng)對國內(nèi)治療慢性病毒性肝炎肝纖維化的中藥方劑進(jìn)行了Meta分析，得出復(fù)方861、八味抗纖方、扶正化瘀膠囊、化肝纖沖劑、強肝膠囊和復(fù)方鱉甲軟肝片抗肝纖維化作用顯著［1，2］的結(jié)論。為進(jìn)一步比較，我們用薄層色譜對6個方劑的脂溶性及／或水溶性進(jìn)行初探，用高效液相色譜（HPLC）對成分保留時間進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 主要儀器 薄層色譜硅膠板G／GF254購自青島海洋化工廠；Water高效液相色譜儀，包括2489紫外檢測器和1525型二元高壓梯度泵；液相色譜柱為Symmetry C18柱（5μm，4.6× 250 mm）；ZF-Z型三用紫外儀購自上海市安亭電子儀器廠，BS210S型電子天平購自北京賽多利斯天平有限公司，KQ3200DV型數(shù)控超聲波清洗器購自昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試劑 三氯甲烷（20130827，分析純），乙酸乙酯（20120312，分析純），甲苯（20110105，分析純），甲醇1（20140410，分析純），甲醇2（20150620，色譜純），乙腈（20150612，色譜純），甲酸（20130810，分析純），石油醚（20140311，分析純），乙醚（20140520，分析純）。藥物：復(fù)方861（京藥制字Z20063100），強肝膠囊（國藥準(zhǔn)字Z10980012），扶正化瘀膠囊（國藥準(zhǔn)字Z20020073），復(fù)方鱉甲軟肝片（國藥準(zhǔn)字Z19991011），八味抗纖方（黃芪30g，白術(shù)、郁金、陳皮、黨參、丹參、黃芩、石菖蒲各12g）和化肝纖沖劑（黃芪30g，三七10g，白芍20g，丹參、莪術(shù)、茯苓、海藻、昆布各15g）中每味中藥均購自山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院中藥房，由醫(yī)院中藥制劑室煎制、烘干及研粉）。

1.3 試驗方法

1.3.1 脂溶性薄層色譜法：參照丹參酮ⅡA薄層色譜方法。經(jīng)預(yù)試驗，色譜信息量較大者為供試確定量，復(fù)方861粉末15g，余5個方劑粉末各1.0g，分別加乙醚20.0ml，振搖，超聲30min，濾過揮干，加乙酸乙酯1ml溶解，作為供試品溶液。吸取供試品溶液各5.0μl，點于硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（4：1）為展開劑，于雙槽展開箱的一側(cè)加入，預(yù)平衡15min，上行展開，展距17cm，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇，加熱至斑點顯示清晰，置紫外光燈（365nm）下檢視。

1.3.2 水溶性薄層色譜法：參照丹酚酸B薄層色譜方法。經(jīng)預(yù)試驗，色譜信息量較大者為供試確定量，取復(fù)方861粉末15g，余5個方劑粉末各2.0g，分別加75%甲醇25.0ml，加熱回流1h，濾過，濾液濃縮至1.0ml，作為供試品溶液。吸取供試品溶液各5.0μl，點于硅膠GF254薄層板上，以甲苯-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（2：3：4：0.5：2）為展開劑，于雙槽展開箱的一側(cè)加入，預(yù)平衡15min，上行展開，展距8cm，取出，晾干，置紫外光燈（254nm）下檢視。

1.3.3 高效液相色譜檢測法：參照中國藥典毛蕊異黃酮葡萄糖苷方法。流速為1m l／min，檢測波長260nm，流動相A為乙腈，流動相B為0.2%甲酸溶液，用0.45μm微孔濾膜過濾，超聲脫氣，備用。流動相梯度洗脫程序：時間0～20min，20～40%流動相A和80～60%流動相B；時間20～30min，40%流動相A和60%流動相B。稱取煎劑粉末各1.0g，復(fù)方861粉末15.0g，余成藥粉末各2.0g，于圓底燒瓶中精密加入純甲醇50ml，稱定重量，加熱回流4小時，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液25.0ml至干，再加甲醇溶解至5ml量瓶中，搖勻，即得供試品溶液。供試品溶液各10μl注入液相色譜儀；重復(fù)測定兩次，色譜峰保留時間重現(xiàn)性穩(wěn)定。

2 結(jié)果

2.1 不同抗肝纖維化方劑薄層色譜法試驗結(jié)果 脂溶性方法薄層色譜結(jié)果顯示復(fù)方鱉甲軟肝片脂溶性成分熒光斑點稀少；復(fù)方861、八味抗纖方、強肝膠囊和化肝纖沖劑脂溶性成分斑點缺如；而扶正化瘀膠囊脂溶性成分熒光斑點顯著（見圖1）。

水溶性方法薄層色譜結(jié)果顯示6種方劑均出現(xiàn)顯著水溶性成分斑點，部分呈現(xiàn)重疊。其中扶正化瘀膠囊水溶性成分斑點數(shù)目較其他方劑顯著（見圖2）。（由左至右依次為復(fù)方861、八味抗纖方、強肝膠囊、扶正化瘀膠囊、化肝纖沖劑、復(fù)方鱉甲軟肝片、丹參、黃芪）

圖1 各方脂溶性圖譜

圖2 各方水溶性圖譜

2.2 不同抗肝纖維化方劑高效液相色譜法試驗結(jié)果 6個方劑HPLC指紋圖譜見圖3～8。HPLC檢測報告顯示復(fù)方861、八味抗纖方、強肝膠囊、扶正化瘀膠囊、化肝纖沖劑和復(fù)方鱉甲軟肝片的保留時間個數(shù)分別是45、37、43、45、25和31，6方劑中9個色譜峰保留時間相同。

圖3 復(fù)方861指紋圖譜

圖4 八味抗纖方指紋圖譜

圖5 強肝膠囊指紋圖譜

圖6 扶正化瘀膠囊指紋圖譜

圖7 化肝纖沖劑指紋圖譜

圖8 復(fù)方鱉甲軟肝片指紋圖譜

3 討論

中藥方劑成分復(fù)雜，對其成分探索十分必要。我們前期對國內(nèi)著名抗肝纖維化方劑做了Meta分析，得出復(fù)方861、八味抗纖方、扶正化瘀膠囊、化肝纖沖劑、強肝膠囊和復(fù)方鱉甲軟肝片在慢性病毒性肝炎抗肝纖維化中作用顯著［3～8］的結(jié)論。6個抗肝纖維化方劑交集藥味是丹參和黃芪，鑒于中國藥典黃芪HPLC檢測給出了具體的流動相梯度洗脫程序，故，采納黃芪HPLC方法。本文薄層色譜結(jié)果顯示6個抗肝纖維化方劑水溶性成分是主要的，僅扶正化瘀膠囊脂溶性成分顯著，值得今后研究中關(guān)注。HPLC顯示的6個方劑間色譜峰保留時間25～45個；6個方劑間有9個色譜峰保留時間相同，提示少部分成分相似或相同；從本次研究結(jié)果看，不同成分的方劑具有相同抗肝纖維化藥理作用，抗肝纖維化的多靶點效應(yīng)和中醫(yī)中藥一病多方是有可能的，但是，新的問題又?jǐn)[在我們面前，少部分相似或相同成分是否承擔(dān)了君藥的作用，幾十種成分中，哪些成分是有藥理活性作用的，哪些成分是有副作用的，哪些成分是無用的，今后的研究任重道遠(yuǎn)。

［1］ 郝立然，李娜，李海玲，等.復(fù)方中藥治療慢性病毒性肝炎肝纖維化的Meta分析［J］.臨床醫(yī)藥實踐，2011，20（7）：494－497.

［2］ 李娜，李海玲，郝立然，等.復(fù)方中藥治療慢性病毒性肝炎肝纖維化的Meta分析和重要的組分及有效成分［J］.臨床醫(yī)藥實踐，2012，21（6）：407－416.

［3］ 王寶恩，趙洪濤，王泰玲，等.復(fù)方861對肝炎肝纖維化療效的病理組織學(xué)分析［J］.中華肝臟病雜志，1997，5（2）：77－78.

［4］ 劉平，胡義揚，劉成，等.扶正化瘀膠囊干預(yù)慢性乙型肝炎肝纖維化作用的多中心臨床研究［J］.中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報，2003，1（2）：89－102.

［5］ 江宇泳，王憲波，王融冰.八味抗纖方治療慢性乙型肝炎肝纖維化的臨床研究［J］.北京中醫(yī)藥，2010，29（7）：487－489.

［6］ 楊柳明，徐克成，趙延龍，等.強肝膠囊治療慢性乙型肝炎肝纖維化的臨床病理研究［J］.胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2001，10（3）：247－249.

［7］ 陳菊梅，楊永平，陳德永，等.復(fù)方鱉甲軟肝片治療慢性乙型肝炎肝纖維化的臨床研究［J］.中華實驗和臨床病毒學(xué)雜志，2007，21（4）：358－360.

［8］ 胡振斌，石清蘭，毛德文，等.化肝纖沖劑抗慢性乙型肝炎肝纖維化療效觀察［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2008，35（4）：556－557.

Analysis of Traditional Chinese M edicine Prescriptions on Anti-liver Fibrosis w ith Thin Layer and High Performance Liquid Chromatography

PENGQiao ling，HAN Zi yan.Digestive Department，The Second Hospital of ShanxiMedical University（Shanxi Taiyuan030001）China

Objective：To discuss the composition properties of Traditional Chinese Medicine（TCM）Prescriptions of anti-liver fibrosis.Methods：Compound 861 Granule，Eight-ingredient Anti-fibrosis Decoction，Qianggan Capsule，F(xiàn)uzheng Huayu Capsule，Huaganxian Granule and Fufang Biejia Ruangan Tablet were analyzed with thin layer chromatography（TLC）and high performance liquid chromatography（HPLC）.Lipid-solublemethod of tanshinoneⅡA and water-solublemethod of salvianolic acid B were performed on TLC.Calycosin glucoside Method of HPLC was performed.Results：TLC showed that the water soluble components of six prescriptions were significant.The numbers of retention times of six prescriptions of TCM were 45、37、43、45、25 and 31 in above order.The numbers of the same retention timewere nine.Conclusions：Water soluble components are predominant in six TCM prescriptions of anti-liver fibrosis.There are dozens of components and a small number of overlapping of retention time in above TCM.A few of traditional Chinesemedicine prescriptionsmay be used in the same disease with liver fibrosis.

Traditional Chinese Medicine；liver fibrosis；thin layer chromatograph；high performance liquid chromatograph

10.3969／j.issn.1005－0264.2017.02.014

2016－05－08 編輯：吳輝坤）

△通訊作者，E-mail：rweiliaoshi＠126.com