miR-214在胃癌患者外周血中的表達及其臨床意義

陳 琳 白義鳳 羅樹春

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miR-214在胃癌患者外周血中的表達及其臨床意義

陳 琳 白義鳳 羅樹春

目的 探討miR-214在胃癌中的表達及臨床意義。方法 采用實時熒光定量PCR法，檢測40例胃癌患者癌組織及癌旁組織中miR-214的差異表達；同時檢測血漿miR-214在56例胃癌患者及40例正常組織中的表達。結果 miR-214在胃癌組織中的表達水平明顯高于癌旁組織；與正常組織比較，胃癌患者中的血漿miR-214表達明顯增高；血漿miR-214表達與患者性別、年齡無關，與疾病分期及生存期密切相關,差異具有統計學意義(P<0.05)；Cox回歸分析發現疾病分期、miR-214的表達可作為獨立的預后因子(P<0.05)。結論 循環miR-214表達與胃癌腫瘤分期和生存時間相關,檢測循環miR-214可能作為評估胃癌患者臨床預后的靶基因。

胃癌；實時熒光定量PCR；循環miR-214

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:894～899)

胃癌是最常見的消化系統惡性腫瘤，在惡性腫瘤死亡率中居第二位，我國是胃癌的高發區，胃癌確診的患者約90%為進展期，五年生存率不足25%[1]。因此早發現、早診斷、早治療仍然是包括胃癌在內的所有腫瘤診治的關鍵[2]。MicroRNA是1種內源性的非編碼RNA(ncRNA)，由17～25個堿基組成的單鏈RNA分子，廣泛存在于各種生物體中，在轉錄和轉錄后水平調控細胞生命活動。近年來的研究發現miRNA在很多腫瘤中異常表達，與腫瘤的形成、侵襲轉移、分期預后、治療反應、療效預測等密切相關[3-4]。血漿里同樣可以檢測到miRNA，循環的miRNA來源于腫瘤組織，受內源性RNA酶的保護[5]具有較好的穩定性和特異性。可作為潛在的無創性診斷、治療和預后評估的分子生物學標志物[6]。目前在淋巴瘤、前列腺癌、胃癌、結直腸癌患者血漿中檢測到腫瘤相關的miRNA[7-9]。miR-214是miRNAs家族中的1個重要分子，在前期大量的研究表明miR-214在不同組織來源腫瘤中表達水平也各有不同，其表達水平與腫瘤的臨床特征具有相關性，也可通過不同途徑影響腫瘤的發生、進展以及藥物治療耐藥性等多個方面[10]。研究發現,miR-214 在鼻咽癌[11],骨肉瘤[12],膠質瘤[13],膀胱癌[14-15]等腫瘤中表達升高。Yang等[16]發現,在353 例的臨床胃癌 miRNA 表達譜中,let-7g 和 miR-433 的低表達與miR-214的高表達是胃癌浸潤度、侵襲、淋巴結轉移及分期的獨立危險因素；Wang等[17]的研究發現miR-214,miR-221和miR-222 在胃癌間充質干細胞及胃癌組織中高表達，其表達與淋巴結轉移、靜脈血栓和TNM分期相關，以上研究結果高度提示 miR-214在胃癌浸潤轉移當中發揮重要的作用。然而關于血漿miR-214在胃癌患者血液標本中的表達及與臨床預后的關系的研究目前國內外尚未見相關報道。

1 材料與方法

1.1 臨床標本收集

56例胃癌患者血液標本為確診胃癌后尚未行放化療和手術治療的標本，其中40例接受手術治療，16例未行手術，標本取自2008年1月至2013年3月就診于四川省人民醫院腫瘤科、胃腸外科的患者，本研究經本院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。隨訪：56例患者出院后均隨訪，隨訪方式為電話隨訪和復查隨訪，隨訪內容包括一般情況、臨床癥狀及影像學檢查。隨訪起點為確診日期，末次隨訪時間為2013年3月31日，至隨訪截止日，依然生存20例，死亡36例，無失訪病例。

1.2 RNA的提取

血漿RNA提取：500 μL低溫保存的血漿標本，置于冰上融化，且充分混勻。加入500 μL TRIzol，vortex 劇烈震蕩30 s，室溫靜置5 min;加200 μL異丙醇，顛倒混勻，vortex 劇烈震蕩2 min(至液體透明)，室溫靜置5 min;4 ℃，離心半徑6.9 cm，13 000 r/min離心15 min將上清液移至新eppendorf管;加500 μL三氯甲烷，顛倒混勻，vortex劇烈震蕩1 min，室溫靜置5 min;4 ℃，離心半徑6.9 cm，13 000 r/min離心15 min，將上清移至新的eppendorf 管;加0.75體積的異丙醇至上清中，顛倒混勻，室溫靜置10 min;4 ℃，離心半徑6.9 cm，13 000 r/min離心10 min，沉淀RNA;吸棄上清，沉淀用體積分數75%乙醇洗1次;4 ℃，離心半徑6.9 cm，7 500 r/min離心5 min，沉淀RNA;吸凈乙醇，30 μLDEPC水溶解RNA。

組織RNA提取：收集胃癌癌組織及癌旁組織(約50～100 mg)在液氮中磨成粉末后，加入1 ml Trizol液研磨(樣品總體積不超過所用Trizol體積的10%)，分別移入去RNA酶的EP管中，提取總RNA。

1.3 實時熒光定量PCR分析miR-214的表達

將上述血漿及組織中提取的RNA進行逆轉錄和實時熒光定量PCR。逆轉錄反應程序為：16 ℃ 30 min,42 ℃ 30 min,85 ℃ 10 min。結束后立即將cDNA產物取出，快速置于冰上冷卻，后續所有步驟均在冰上進行。將cDNA產物稀釋3～4倍，然后混勻并從中吸取2 μl(20 μl體系)做為定量PCR的模板，剩余產物存放于-20 ℃。PCR反應在ABI7500實時定量PCR反應儀上進行，程序為(95 ℃3 min,);40 cycles×(95 ℃ 12 s,62 ℃ 1 min);95 ℃ 15 s 。反應結束后確認Real Time PCR的擴增曲線和融解曲線，進行PCR定量時制作標準曲線等。3次獨立實驗后得到的數據運用公式2-△△Ct的方法進行分析[18]。△△ct=(待測樣品的目的基因的Ct的平均值-待測樣本的看家基因的Ct的平均值)-(對照樣品的目的基因的Ct的平均值一對照樣本的看家基因的Ct的平均值)。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 臨床病理特征

56例胃癌患者血液標本為確診胃癌后尚未行放化療和手術治療的標本，其中40例接受手術治療，16例未行手術，其中男性27例，女性29例；年齡30～82歲，中位年齡53歲，53歲以下患者25例，53歲以上患者31例；其中胃腺癌50例，平滑肌肉瘤1例、鱗癌2例、腺鱗癌2例、類癌1例。臨床分期：Ⅰ期(T1N0M0-T1N1M0)患者15例，Ⅱ期(T1N2M0-T3N0M0)12例，Ⅲ期(T2N2M0-T4N0M0)13例，Ⅳ期(任何TN,M1)16例。56例患者中合并糖尿病者3例，合并其他心血管疾病者2例。40例胃癌組織標本及癌旁組織標本為胃癌術后活檢組織，所有標本均為經病理學檢查確診的胃癌，全部病例獲取前均未行化療和放療，臨床資料完整。40例正常血液標本取自正常人體檢血液標本，體檢證實未患腫瘤及其他疾病(表1)。

2.2 miR-214 在胃癌患者血液及組織中的表達

采用QRT-PCR對40例胃癌組織標本中miR-214的表達進行檢測，結果提示miR-214在胃癌患者癌組織中的表達較癌旁組織明顯增高,差異具有統計學意義(圖1A，P<0.001)。ROC曲線比較miR-214在胃癌組織和癌旁組織中的表達，曲線下面積(AUC)為0.707(95% CI=0.519～0.874,P=0.009，圖1B及表2)。根據ROC曲線，將miR-214=0.674作為判定胃癌的閾值，根據這個閾值，預測其敏感度、特異度、真陽性率和假陰性率分別為65.8%(95% CI,53.2～75.3),88.3%(95% CI,77.1～99.9),100.0%(95% CI,83.5～99.6),43.5%(95% CI,25.5～65.2)。

表1 胃癌患者及正常人的臨床特征/例

同時，采用QRT-PCR對56例胃癌患者和40例正常人血漿中miR-214的表達進行檢測，結果提示miR-214在56例胃癌患者血漿中其表達明顯高于健康對照組,差異具有統計學意義(P<0.001,圖2A，表2),ROC曲線圖提示曲線下面積為0.820(95% CI =0.740～0.900,P<0.001,圖2B)。miR-214=0.62作為判定胃癌的閾值，根據這個閾值，預測其敏感度、特異度、真陽性率和假陰性率分別為61.3%(95% CI,50.32～72.17),83.6%(95% CI,78.7～99.6),100.00%(95% CI,85.5～99.9),45.5%(95% CI,26.31～64.27)。

A為QRT-PCR檢測m，B為ROC曲線分析。

A為QRT-PCR檢測；B為ROC曲線分析。

2.3 miR-214表達與胃癌臨床病理特征的關系

分析循環miR-214的表達與胃癌患者年齡、性別、疾病分期的關系，結果發現，miR-214表達與患者性別、年齡無相關性，差異無統計學意義(表2)(P均大于0.05)；與疾病分期密切相關，差異具有統計學意義(P均<0.001；表2)。

表2 miR-214表達與患者臨床特征的關系/例

#以2-△△ct<1為miR-214低表達，2-△△ct>1為miR-214高表達[19]。

2.4 胃癌患者生存分析

采用Kaplan-Meier法估計患者生存時間，結果發現男性患者與女性患者的生存時間無統計學意義(χ2=12.525，P=0.830)，不超過53歲的患者與53歲以上患者生存時間無統計學意義(χ2=7.049，P=0.902)；miR-214低表達者的生存時間長于高表達者，差異具有統計學意義(χ2=17.774，P<0.001)；患者的TNM分期越晚者生存時間越短，差異具有統計學意義(χ2=61.180，P<0.001)見圖3A,B。

Cox回歸分析患者的性別、年齡、疾病分期及miR-214表達與患者預后的關系，發現疾病分期和miR-214可作為獨立的預后因子，TNM分期越晚的相對危險度為7.642，95%相對危險度的可信區間為(2.329～25.080),差異具有統計學意義(W=11.250,P=0.001)；miR-214高表達的相對危險度為8.632，95%相對危險度的可信區間為(4.015～23.351)，差異具有統計學意義(W=8.224,P=0.004)見表3。

3 討論

我國胃癌具有發病率高、早期診斷率低、5年生存率低等特點。胃癌的早期診斷率仍徘徊在10%～20%，是導致其死亡率居高居不下的主要原因之一[2]。目前手術治療是唯一經證實的可能會治愈胃癌的手段，但即便是已行胃癌根治術的患者，仍有大部分會出現復發或轉移。術后的輔助放化療對控制胃癌的復發或轉移可能有效。化療在晚期胃癌患者的綜合性治療中亦發揮重要作用，然而耐藥一直以來是胃癌化療遇到一個很大瓶頸[20-21]。由此得出，胃癌的早期診斷和及時有效的治療是提高其5年生存率的關鍵，所以尋找敏感而特異性強的分子標志物、明確治療的分子靶標以及正確的進行預后評估則是至關重要的任務。miRNA在不同種腫瘤中的差異表達及其與腫瘤的分類和診斷的相關性,提示其可能成為腫瘤預后檢測的重要生物標志分子[8]。過去一直認為 miRNAs可能被細胞外大量存在的RNA酶所降解,初期研究主要針對細胞內miRNAs。2008 年,牛津大學 Lawrie 等[22]首次報道B 細胞淋巴瘤血清中miR-155,miR-210及miR-21 增高。隨后大量實驗證明miRNAs可以廣泛而穩定地存在于細胞外液,包括血清、血漿、組織間液及各類體液中,統稱為循環miRNAs(circulating miRNAs)[23]。迄今已報道在健康人血液循環中約含有1800多種miRNAs。循環miRNAs作為1種非創傷性檢測標志物,是人類疾病診斷與防治新的研究靶標。有關循環miRNAs作為生物標志物的研究目前主要集中于腫瘤,約占總體研究報道的80%左右。Lawrie 等[22]首次報道B細胞淋巴瘤血清中miR-155、miR-210及miR-21增高,且血清miR-21水平高的患者無復發生存期更長。Wong 等[24]發現 miR-184 不僅高表達于舌鱗狀細胞癌組織局部,也表達于外周血中,其水平在手術后顯著降低。Mitchell 等[25]用基因芯片和測序技術直接測定前列腺癌患者與小鼠模型血漿中的miRNAs,證實血漿中miR-141可用于前列腺癌的鑒別診斷。Wu 等[26]報道乳腺癌 患者血清中 miR-21 和 miR-29 顯著升高,可望成為乳腺癌的生物標志物。還有研究顯示，血漿 miR-200c可能作為預測胃癌預后及生存時間的生物學標記物；miR-421 及miR-375作為診斷晚期胃癌的1個功能性標志物[27-28]。然而關于循環miR-214在胃癌血漿中的表達及其意義目前尚未見相關報道。我們采用QRT-PCR分別對40例胃癌患者癌組織及癌旁組織,56例胃癌病人和40例正常人血漿中miR-214的表達進行檢測，發現胃癌病人組織標本中miR-214的相對表達水平明顯高于癌旁組織；循環中miR-214的相對表達水平明顯高于健康對照組。ROC曲線分析證實miR-214作為區分胃癌患者和正常對照的潛在分子標記。miR-214的表達與患者的性別、年齡無相關性，與患者的疾病分期及生存期密切相關。采用Kaplan-Meier法估計患者生存時間，患者的生存時間與性別、年齡無關，與疾病的分期及miR-214的表達相關。Cox回歸分析發現疾病分期和miR-214可能作為獨立的預后因子。我們的研究結果與Zhang等[29]在胰腺癌中發現miR-214在胰腺癌中是高表達的，并且miR-214可通過抑制靶基因ING4的表達從而降低胰腺癌細胞對吉西他濱化療藥物的敏感性。Yu等[30]的研究也表明miR-214可提高人舌鱗癌細胞株的化療敏感性一致。本研究結果可能為基于miR-214判斷胃癌預后的研究提供一定的理論基礎和治療靶點，然而影響胃癌預后的因素很多，miR-214是通過何種途徑影響胃癌的發生、發展及其機制目前尚未完全闡明，值得進一步研究。

圖3 miR-214表達及疾病分期與患者生存時間的關系

表3 Cox回歸分析疾病分期和miR-214表達與胃癌預后的關系

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(編輯：吳小紅)

Expression and Significance of miR-214 in Patients with Gastric Cancer

CHENLin,BAIYifeng,LUOShuchun.

SichuanProvincialPeople'sHospital，Sichuan,610000

Objective To analyze the expression of miR-214 in gastric cancer,and its clinical significance.Methods The expression of miR-214 were confirmed in primary gastric cancer tissues and para-carcinoma tissues by QRT-PCR；Meanwhile，the expression of plasma miR-214 were detected in 56 consecutive gastric cancer patients and 40 healthy volunteers and the clinical significance was evaluated.Results Expression of miR-214 was significantly higher in gastric cancer tissues than in para-carcinoma tissues；Plasma miR-214 concentrations were significantly higher in gastric cancer patients than that in normal people(P<0.05)；The expression of plasma miR-214 were not associated with gender,and age(P>0.05),but significantly correlated with overall survival and clinical stage(P<0.001).Cox regression analysis found that plasma miR-214 expression and disease stage were independent prognostic factors for the gastric cancer patients.Conclusion Plasma miR-214 is related with clinical stage and survival of gastric cancer,it could be a useful biomarker for evaluation of prognosis of gastric cancer.

Gastric cancer;QRT-PCR;miR-214

610000 四川省人民醫院

羅樹春

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.06.007

R735.2

A

1001-5930(2017)06-0894-06

2016-06-08

2017-04-10)